酵母双杂交筛选
筛选与Cpn0308相互作用的宿主蛋白。
构建pGBKT7-Cpn0308诱饵质粒,转化酵母菌株AH109,与含有HeLa细胞cDNA文库的Y187酵母菌株杂交,通过β-半乳糖苷酶染色和菌落PCR筛选阳性克隆,测序并BLAST比对。
The Chlamydia pneumoniae inclusion membrane protein Cpn0308 interacts with host protein ACBD3.
包含酵母双杂交、免疫共沉淀、GST pull-down、免疫荧光共定位和ELISA等实验,涉及体外和细胞内验证,但缺乏动物模型和功能实验。
HeLa细胞 肺炎衣原体AR39感染的HeLa细胞
酵母双杂交筛选使用AH109和Y187酵母菌株 免疫共沉淀使用Myc抗体琼脂糖珠,共转染pcDNA3.1/Myc-His-Cpn0308和pcDNA3.1+/Flag-ACBD3 GST pull-down使用GST-Cpn0308和Flag-ACBD3 ACBD3片段包括100-184、100-245、246-528、400-528 ELISA包被ACBD3片段,浓度4.0 μg/mL
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选与Cpn0308相互作用的宿主蛋白。
构建pGBKT7-Cpn0308诱饵质粒,转化酵母菌株AH109,与含有HeLa细胞cDNA文库的Y187酵母菌株杂交,通过β-半乳糖苷酶染色和菌落PCR筛选阳性克隆,测序并BLAST比对。
在HeLa细胞中验证Cpn0308与ACBD3的相互作用。
将pcDNA3.1/Myc-His-Cpn0308和pcDNA3.1+/Flag-ACBD3共转染HeLa细胞,培养48小时后裂解,用抗Myc琼脂糖珠沉淀,SDS-PAGE和Western blot检测。
在体外验证Cpn0308与ACBD3的相互作用。
利用GST-Cpn0308作为诱饵蛋白,与Flag-ACBD3共孵育,通过谷胱甘肽琼脂糖珠沉淀,Western blot检测。
观察Cpn0308与ACBD3在细胞内的共定位情况。
共转染或感染后,用抗Myc和抗Flag抗体标记,或使用抗Cpn0308和抗ACBD3抗体,通过激光扫描共聚焦显微镜观察。
确定Cpn0308在ACBD3上的具体结合区域。
表达ACBD3的四个截短片段(100-184, 100-245, 246-528, 400-528),通过GST pull-down和ELISA检测Cpn0308与这些片段的结合。
预测Cpn0308和ACBD3的三维结构并分析结合位点。
使用Rosetta在线服务器预测结构,GROMACS进行分子动力学优化,Ramachandran图评估模型,Vakser Lab软件对接,PDBePISA分析氢键和盐桥。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 酵母双杂交 | Matchmaker GAL4双杂交系统 | Clontech | 630489 |
| HeLa细胞cDNA文库 | Be Na Culture Collection | 342189 | |
| 细胞培养 | Lipofectamine 2000转染试剂 | -- | -- |
| 免疫共沉淀 | Pierce抗c-Myc琼脂糖珠 | Thermo Fisher | 20168 |
| 小鼠抗Flag抗体 | Sigma | F1804 | |
| 兔抗c-Myc抗体 | Bioss | bs-24507R | |
| GST pull-down | Pierce GST蛋白相互作用Pull-Down试剂盒 | Thermo Fisher | 21516 |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠IgG-Cy3 | Bioss | bs-0296G-Cy3 |
| 山羊抗兔IgG-FITC | Bioss | bs-0295G-FITC | |
| 抗ACBD3抗体 | Proteintech | 14096-1-AP | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Nikon | A1SiR | |
| ELISA | 小鼠抗GST抗体 | Proteintech | 66001-1-Ig |
| 山羊抗小鼠HRP偶联抗体 | Bioss | bs-0296G-HRP | |
| ELISA读板仪 | Thermo Fisher | MK3 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 酵母双杂交 | 酵母菌株AH109和Y187,文库为HeLa cDNA文库,杂交时间16小时,30°C 阅读提示:Methods中Y2H screening部分 |
| 免疫共沉淀 | 共转染质粒pcDNA3.1/Myc-His-Cpn0308和pcDNA3.1+/Flag-ACBD3,培养48小时,使用抗Myc琼脂糖珠 阅读提示:Methods中Co-immunoprecipitation assay部分 |
| GST pull-down | GST-Cpn0308与Flag-ACBD3或片段共孵育,使用Pierce试剂盒 阅读提示:Methods中GST pull-down assay部分 |
| 免疫荧光 | 共转染后24小时固定,或感染肺炎衣原体(Cpn0308),使用抗Myc、抗Flag、抗Cpn0308、抗ACBD3抗体 阅读提示:Methods中Immunofluorescence microscopy部分及Figure 5 |
| ELISA | ACBD3片段包被浓度4.0 μg/mL,100 µL每孔,4°C过夜,检测GST-Cpn0308结合 阅读提示:Methods中Enzyme-linked immunosorbent assay部分及Figure 8 |