肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308与宿主蛋白ACBD3相互作用

The Chlamydia pneumoniae inclusion membrane protein Cpn0308 interacts with host protein ACBD3.

作者信息Liang Ma, Xiao-Hui Jia, Zhe Gao, Yan Zhou, Yong-Ting Cheng, Ping Li, Tian-Jun Jia
PMID39723831
发布时间2025-01-31
DOI10.1128/jb.00275-24

实验完整度

包含酵母双杂交、免疫共沉淀、GST pull-down、免疫荧光共定位和ELISA等实验,涉及体外和细胞内验证,但缺乏动物模型和功能实验。

主要模型

HeLa细胞 肺炎衣原体AR39感染的HeLa细胞

重点核对

酵母双杂交筛选使用AH109和Y187酵母菌株 免疫共沉淀使用Myc抗体琼脂糖珠,共转染pcDNA3.1/Myc-His-Cpn0308和pcDNA3.1+/Flag-ACBD3 GST pull-down使用GST-Cpn0308和Flag-ACBD3 ACBD3片段包括100-184、100-245、246-528、400-528 ELISA包被ACBD3片段,浓度4.0 μg/mL

摘要

肺炎衣原体是一种专性胞内寄生的真核细胞细菌,具有独特的双相生命周期;其生物合成和复制必须发生在细胞质空泡或包涵体内。某些包涵体膜蛋白已被证明可介导包涵体内衣原体与宿主细胞之间的相互作用。先前的研究已证明,肺炎衣原体编码的Cpn0308定位于包涵体膜;然而,其功能仍未知。在本研究中,通过酵母双杂交实验以Cpn0308为诱饵筛选HeLa细胞cDNA文库,发现其与宿主蛋白酰基辅酶A结合域蛋白3(ACBD3)结合。通过免疫共沉淀和GST(谷胱甘肽S-转移酶)pull-down实验证实了Cpn0308与ACBD3之间的相互作用。在共表达Cpn0308和ACBD3的HeLa细胞中,以及在肺炎衣原体感染的细胞中,通过共聚焦荧光显微镜观察到这两种蛋白也共定位。鉴于ACBD3在维持宿主细胞脂质稳态中发挥关键作用,且其高尔基体动态结构域负责与Cpn0308相互作用,我们假设Cpn0308-ACBD3相互作用可能促进肺炎衣原体获取宿主脂质,从而有利于衣原体生存。本研究为进一步阐明Cpn0308介导的肺炎衣原体致病机制奠定了基础。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308的宿主细胞结合伴侣及其功能是什么?
核心机制
Cpn0308与宿主蛋白ACBD3的GOLD结构域结合,可能通过与giantin竞争ACBD3或促进ACBD3复合物形成,帮助衣原体获取宿主高尔基体脂质。
主要证据
酵母双杂交筛选出ACBD3,免疫共沉淀和GST pull-down验证了相互作用,免疫荧光显示共定位,ELISA和pull-down实验证实Cpn0308与ACBD3的GOLD结构域(246-528及400-528)结合。
研究意义
该研究为阐明Cpn0308介导的肺炎衣原体致病机制奠定了基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

酵母双杂交筛选

筛选与Cpn0308相互作用的宿主蛋白。

构建pGBKT7-Cpn0308诱饵质粒,转化酵母菌株AH109,与含有HeLa细胞cDNA文库的Y187酵母菌株杂交,通过β-半乳糖苷酶染色和菌落PCR筛选阳性克隆,测序并BLAST比对。

2

免疫共沉淀验证

在HeLa细胞中验证Cpn0308与ACBD3的相互作用。

将pcDNA3.1/Myc-His-Cpn0308和pcDNA3.1+/Flag-ACBD3共转染HeLa细胞,培养48小时后裂解,用抗Myc琼脂糖珠沉淀,SDS-PAGE和Western blot检测。

3

GST pull-down验证

在体外验证Cpn0308与ACBD3的相互作用。

利用GST-Cpn0308作为诱饵蛋白,与Flag-ACBD3共孵育,通过谷胱甘肽琼脂糖珠沉淀,Western blot检测。

4

免疫荧光共定位

观察Cpn0308与ACBD3在细胞内的共定位情况。

共转染或感染后,用抗Myc和抗Flag抗体标记,或使用抗Cpn0308和抗ACBD3抗体,通过激光扫描共聚焦显微镜观察。

5

确定Cpn0308结合ACBD3的结构域

确定Cpn0308在ACBD3上的具体结合区域。

表达ACBD3的四个截短片段(100-184, 100-245, 246-528, 400-528),通过GST pull-down和ELISA检测Cpn0308与这些片段的结合。

6

蛋白结构预测与分子对接

预测Cpn0308和ACBD3的三维结构并分析结合位点。

使用Rosetta在线服务器预测结构,GROMACS进行分子动力学优化,Ramachandran图评估模型,Vakser Lab软件对接,PDBePISA分析氢键和盐桥。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Matchmaker GAL4双杂交系统Clontech630489
HeLa细胞cDNA文库Be Na Culture Collection342189
Lipofectamine 2000转染试剂----
Pierce抗c-Myc琼脂糖珠Thermo Fisher20168
小鼠抗Flag抗体SigmaF1804
兔抗c-Myc抗体Biossbs-24507R
Pierce GST蛋白相互作用Pull-Down试剂盒Thermo Fisher21516
山羊抗小鼠IgG-Cy3Biossbs-0296G-Cy3
山羊抗兔IgG-FITCBiossbs-0295G-FITC
抗ACBD3抗体Proteintech14096-1-AP
激光扫描共聚焦显微镜NikonA1SiR
小鼠抗GST抗体Proteintech66001-1-Ig
山羊抗小鼠HRP偶联抗体Biossbs-0296G-HRP
ELISA读板仪Thermo FisherMK3

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
酵母双杂交
酵母菌株AH109和Y187,文库为HeLa cDNA文库,杂交时间16小时,30°C
阅读提示:Methods中Y2H screening部分
免疫共沉淀
共转染质粒pcDNA3.1/Myc-His-Cpn0308和pcDNA3.1+/Flag-ACBD3,培养48小时,使用抗Myc琼脂糖珠
阅读提示:Methods中Co-immunoprecipitation assay部分
GST pull-down
GST-Cpn0308与Flag-ACBD3或片段共孵育,使用Pierce试剂盒
阅读提示:Methods中GST pull-down assay部分
免疫荧光
共转染后24小时固定,或感染肺炎衣原体(Cpn0308),使用抗Myc、抗Flag、抗Cpn0308、抗ACBD3抗体
阅读提示:Methods中Immunofluorescence microscopy部分及Figure 5
ELISA
ACBD3片段包被浓度4.0 μg/mL,100 µL每孔,4°C过夜,检测GST-Cpn0308结合
阅读提示:Methods中Enzyme-linked immunosorbent assay部分及Figure 8