circRNA表达谱分析
揭示合作猪和长白猪在性成熟前后睾丸中circRNA的表达模式变化
对30日龄和120日龄的合作猪和长白猪睾丸组织进行RNA-seq，鉴定circRNAs并分析差异表达circRNAs
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circRNA分析揭示circPAN3在合作猪支持细胞生长中的调控作用
CircRNA profiling reveals the regulatory role of circPAN3 in Hezuo boars Sertoli cell growth.
实验完整度
高包含RNA-seq、功能实验（CCK-8、流式细胞术、RT-qPCR、Western blot）及动物组织样本，多重验证。
主要模型
合作猪（30日龄和120日龄）睾丸组织 长白猪（30日龄和120日龄）睾丸组织 原代未成熟猪支持细胞（分离自30日龄合作猪）
重点核对
circPAN3过表达质粒pCD25-circPAN3和siRNA（si1-circPAN3）的转染效率验证 circPAN3对未成熟支持细胞增殖（CCK-8）和凋亡（流式细胞术）的影响 PCNA、Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白表达水平变化
摘要
背景：合作猪是中国著名的本土品种，其特点是比国外引进的猪品种性早熟。性成熟是一个复杂的生理过程，近年来，环状RNA（circRNAs）作为一类具有内源性调控功能的非编码RNA，已被证明在调控性成熟中发挥重要作用。然而，circRNAs在合作猪性成熟过程中的动态表达和调控机制仍不清楚。在本研究中，我们进行了RNA测序和生物信息学分析，以揭示30天（性未成熟；Ha）和120天（性成熟；Hb）合作猪睾丸中的circRNA表达模式，并以同龄的长白猪作为对照。随后，对来源于PAN3基因的高丰度circ_005678（circPAN3）通过RT-qPCR、Western Blot、CCK-8和流式细胞术进行了功能研究。结果：我们在12个样本中鉴定了31,134个circRNAs，在Ha-vs-Hb、La-vs-Lb、Ha-vs-La和Hb-vs-Lb组中分别鉴定出2,562、2,401、749和831个差异表达（DE）circRNAs。功能富集分析结果表明，这些DE circRNAs的来源基因主要涉及睾丸发育和精子发生。此外，我们构建了circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络，并对靶基因进行了功能分析。靶基因的GO功能注释表明，它们主要参与腺体发育、细胞增殖和生殖等生物过程。KEGG通路分析进一步揭示，这些基因主要富集在与睾丸发育和精子发生相关的信号通路中，包括PI3K-Akt和MAPK信号通路。细胞实验表明，circPAN3促进未成熟支持细胞增殖并抑制凋亡，而敲低circPAN3则观察到相反的变化。结论：本研究揭示了合作猪性成熟过程中circRNAs的动态表达谱和调控机制。进一步的功能研究表明，circPAN3促进了未成熟支持细胞的增殖并抑制了凋亡，提示circPAN3可能与合作猪的性早熟特征密切相关。这些发现为探索circRNAs在合作猪性早熟中的调控机制提供了新的视角。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 合作猪性成熟过程中circRNAs的表达动态及其在支持细胞生长中的调控机制
- 核心机制
- circPAN3促进未成熟支持细胞增殖并抑制凋亡，可能通过调控PCNA、Bcl-2、Bax和Caspase-3等增殖和凋亡相关基因的表达
- 主要证据
- RNA-seq和生物信息学分析显示circPAN3在性成熟过程中下调，细胞实验表明过表达circPAN3促进增殖、抑制凋亡，敲低则相反
- 研究意义
- 为探索circRNAs在合作猪性早熟中的调控机制提供新视角，可能对改善猪繁殖性能有重要意义
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
功能富集分析
预测差异表达circRNAs来源基因及ceRNA网络中mRNAs的生物学功能
对DE circRNAs来源基因及ceRNA网络中的mRNAs进行GO和KEGG富集分析
原代未成熟支持细胞分离与鉴定
获取纯化的未成熟支持细胞用于功能研究
从30日龄合作猪睾丸分离支持细胞，通过两步酶消化和差速贴壁纯化，并通过RT-PCR和免疫荧光鉴定
circPAN3功能验证
验证circPAN3对未成熟支持细胞增殖和凋亡的影响
过表达和敲低circPAN3后，通过CCK-8、流式细胞术、RT-qPCR和Western blot检测细胞增殖、凋亡及相关基因表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | Trizol试剂盒 | Invitrogen | -- |
| Trizol试剂 | Accurate Biotechnology | -- | |
| RNA-seq文库构建 | QiaQuick PCR纯化试剂盒 | -- | -- |
| UNG酶 | -- | -- | |
| RNA-seq | HiSeq4000测序仪 | Illumina | -- |
| 细胞消化 | IV型胶原酶 | Solarbio | -- |
| 胰蛋白酶 | Gibco | -- | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | -- |
| 高糖DMEM培养基 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | Evo M-MLV逆转录试剂盒（qPCR专用，含gDNA清除） | Accurate Biotechnology | -- |
| 2×SYBR Green Pro Taq HS预混液 | Accurate Biotechnology | -- | |
| 罗氏LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Solarbio | -- |
| 山羊血清 | -- | -- | |
| 兔抗GATA4抗体 | Bioss | -- | |
| 山羊抗兔IgG/Cy3二抗 | Bioss | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 倒置荧光显微镜 | Olympus | IX71 | |
| Western blot | RIPA蛋白裂解液 | Solarbio | -- |
| PMSF | -- | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| PCNA抗体 | Bioss | bs-2007R | |
| Bax抗体 | Bioss | bs-0127R | |
| Bcl-2抗体 | Bioss | bs-4563R | |
| Caspase-3抗体 | Bioss | bs-0081R | |
| HRP标记二抗 | Servicebio | GB15001 | |
| ECL化学发光试剂盒 | Beyotime | -- | |
| CCK-8检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | -- |
| 多功能酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| FACSCalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| PCR引物 | 引物 | Tsingke | -- |
| circPAN3过表达载体构建 | pCD25-ciR载体 | Geneseed | -- |
| siRNA合成 | 靶向circPAN3的siRNA | Jima | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | 合作猪和长白猪各3头，各30日龄和120日龄，睾丸组织采集后-80°C保存 阅读提示：Materials and methods: Experimental design and sample collection |
| 原代支持细胞分离 | 30日龄合作猪睾丸，胶原酶IV消化1h，0.25%胰酶消化20min，0.05%胰酶传代 阅读提示：Materials and methods: Isolation and culture of immature porcine sertoli cells |
| circPAN3转染 | pCD25-circPAN3过表达质粒和si1-circPAN3（100mol）转染，Lipofectamine 2000 阅读提示：Materials and methods: Transfection of circPAN3 |
| 功能检测 | CCK-8（转染后48h，10μL/孔，孵育3h），流式（Annexin V-FITC/PI），Western blot（PCNA, Bax, Bcl-2, Caspase-3） 阅读提示：Materials and methods: CCK-8 assay, Flow cytometry, Western blot |