JAM3表达分析
验证JAM3在LSCC组织和细胞系中的表达水平。
分析GEO数据集（GSE216664、GSE59102、GSE51985）和CPTAC/ICPC蛋白数据；对38对LSCC及癌旁组织进行IHC；对HaCaT、AMC-HN-8、FD-LSC-1、FaDu、HN30细胞系进行RT-qPCR。
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JAM3的表观遗传沉默通过抑制Hippo通路促进喉鳞状细胞癌的发展
Epigenetic silencing of JAM3 promotes laryngeal squamous cell carcinoma development by inhibiting the Hippo pathway.
实验完整度
高研究包含临床样本IHC分析、多种细胞系体外功能实验（CCK8、集落形成、Transwell）、Western blot和免疫荧光机制验证，以及裸鼠体内移植瘤实验，证据层级丰富且包含功能与机制验证。
主要模型
LSCC细胞系AMC-HN-8和FD-LSC-1 HNSCC细胞系FaDu和HN30 正常表皮细胞系HaCaT BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
细胞系：AMC-HN-8和FD-LSC-1，培养于DMEM或RPMI-1640，添加10% FBS 转染：JAM3过表达质粒p3×Flag-CMV-10-JAM3（1.5 µg/ml）和siRNA si-JAM3-1/si-JAM3-2（37.5 nM），使用Lipofectamine 3000 5-Aza处理：5 µM处理72小时 体内实验：BALB/c裸鼠皮下注射5×10^6 AMC-HN-8细胞，siRNA瘤内注射（0.1 µg/µl，100 µl/次，隔日一次共7次） 统计分析：体外实验重复三次，组间比较采用t检验或单因素方差分析
摘要
喉鳞状细胞癌（LSCC）在头颈部鳞状细胞癌病例中占很大比例，常在晚期才被诊断，凸显了对有效生物标志物和治疗靶点的迫切需求。连接黏附分子3（JAM3）与多种癌症有关；然而，其在LSCC中的作用仍不清楚。因此，本研究旨在探讨JAM3在LSCC中的表观遗传调控及其抑癌功能和机制。生物信息学分析和5-Aza-2′-脱氧胞苷处理恢复了JAM3表达，并通过逆转录定量PCR和western blotting证实，结果显示JAM3启动子的异常高甲基化与LSCC患者中JAM3表达降低及较差的临床结局相关。体外实验，包括Cell Counting Kit 8、集落形成和Transwell实验，表明JAM3过表达抑制了LSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。Western blotting和免疫荧光分析显示，JAM3的抑癌功能是通过激活Hippo通路介导的。相反，体外和体内实验均表明，JAM3敲低通过抑制Hippo通路增强了这些致癌行为，提示其关键的抑癌作用。总之，本研究结果表明，JAM3可能被表观遗传下调，并可能通过Hippo通路在LSCC中充当新型抑癌基因，为开发靶向治疗和诊断提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- JAM3在喉鳞状细胞癌中的表观遗传调控及其抑癌功能和机制尚不清楚，本研究旨在探究JAM3在LSCC中的表达、甲基化状态及其对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
- 核心机制
- JAM3通过激活Hippo通路发挥抑癌作用：JAM3过表达增加LATS1表达和磷酸化，增强YAP1磷酸化，促进YAP1细胞质滞留；JAM3敲低则相反，导致YAP1核积累，从而促进肿瘤进展。
- 主要证据
- 临床样本IHC显示JAM3在肿瘤组织中低表达；BSP和5-Aza处理证实启动子高甲基化导致表达下降；体外功能实验（CCK8、集落形成、Transwell）表明JAM3过表达抑制细胞增殖、迁移和侵袭，敲低则增强；体内裸鼠实验显示JAM3敲低促进肿瘤生长和EMT（Ki-67、N-cadherin、Vimentin升高，E-cadherin降低）。
- 研究意义
- JAM3可能作为LSCC的抑癌基因，其启动子甲基化可作为潜在诊断和预后生物标志物，并为靶向治疗提供见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
启动子甲基化分析
探讨JAM3启动子甲基化状态及其与表达和预后的关系。
分析GEO（GSE33202、GSE33205）和TCGA数据中JAM3表达与甲基化的相关性；使用MethSurv进行生存分析；对AMC-HN-8和FD-LSC-1细胞进行BSP测序；使用5-Aza处理检测JAM3表达恢复。
JAM3功能研究（体外过表达和敲低）
评估JAM3对LSCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
在AMC-HN-8和FD-LSC-1细胞中过表达JAM3（p3×Flag-CMV-10-JAM3）或用siRNA敲低JAM3，进行CCK8、集落形成和Transwell实验。
Hippo通路机制验证
阐明JAM3是否通过Hippo通路调节LSCC细胞行为。
通过Western blot检测LATS1、p-LATS1、YAP1、p-YAP1表达；免疫荧光观察YAP1亚细胞定位。
体内成瘤实验
验证JAM3敲低对LSCC细胞体内致瘤性的影响。
裸鼠皮下注射AMC-HN-8细胞，成瘤后瘤内注射si-JAM3或si-NC，测量肿瘤体积和重量，行H&E和IHC分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Pricella | -- | |
| 胎牛血清 | Shanghai ExCell Biology | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| cDNA合成试剂盒 | TransGen Biotech | AU341 | |
| PerfectStart Green qPCR预混液 | TransGen Biotech | -- | |
| LightCycler 96仪器 | Roche Diagnostics | -- | |
| 5-Aza处理 | 5-Aza-2′-脱氧胞苷 | MilliporeSigma | -- |
| DNA提取 | TIANamp基因组DNA试剂盒 | Tiangen Biotech | DP304 |
| DNA甲基化处理 | EZ DNA甲基化Gold试剂盒 | Zymo Research | D5006 |
| BSP | TransTaq HiFi PCR SuperMix I | TransGen Biotech | -- |
| DuRed核酸染料 | Shanghai Saint-bio Biotechnology | R21868 | |
| SanPrep柱式DNA凝胶回收试剂盒 | Sangon Biotech | B518131 | |
| T1克隆载体 | TransGen Biotech | -- | |
| CCK8实验 | 细胞计数试剂盒8检测试剂 | Shanghai Yeasen Biotechnology | -- |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | Amresco | -- |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| Matrigel基质胶 | Corning | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Shanghai Yeasen Biotechnology | -- | |
| SDS-PAGE上样缓冲液 | Shanghai Yeasen Biotechnology | -- | |
| 脱脂奶粉 | BD Biosciences | -- | |
| 抗Flag抗体 | MilliporeSigma | F1804 | |
| 抗JAM3抗体 | BIOSS | bs-11086R | |
| 抗LATS1抗体 | Proteintech | 17049-1-AP | |
| 抗磷酸化LATS1 (Thr1079)抗体 | Proteintech | 28998-1-AP | |
| 抗YAP1抗体 | Proteintech | 13584-1-AP | |
| 抗磷酸化YAP1 (Ser127)抗体 | Cell Signaling Technology | 13008S | |
| 抗β-actin抗体 | TransGen Biotech | HC201-02 | |
| HRP偶联二抗 | TransGen Biotech | HS101-01, HS201-01 | |
| 增强化学发光检测试剂 | Advansta | K-12045-D50 | |
| MiniChemi 610成像系统 | SinSage Technology | -- | |
| IHC | 牛血清白蛋白 | Beijing Solarbio Science & Technology | -- |
| 抗Ki-67抗体 | Fuzhou Maixin Biotechnology Development | RMA-0731 | |
| 抗E-Cadherin抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| 抗N-Cadherin抗体 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| 抗Vimentin抗体 | Cell Signaling Technology | 5741S | |
| 生物素化二抗 | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology | PV-6000 | |
| PANORAMIC SCAN II扫描仪 | 3DHISTECH | -- | |
| 免疫荧光 | CY3偶联二抗 | Wuhan Boster Biological Technology | BA1032 |
| DAPI染料 | Wuhan Boster Biological Technology | -- | |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织样本IHC | 样本量：38对LSCC和ANM组织；患者年龄范围、性别比例；染色抗体浓度；H-Score评价方法 阅读提示：Materials and methods - Tissue samples; IHC staining; Results - Downregulation of JAM3 in LSCC; Figure 1C and D |
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件：DMEM或RPMI-1640含10% FBS、37°C、5% CO2；HaCaT细胞系需通过STR鉴定 阅读提示：Materials and methods - Cell lines and culture; Table SI |
| 5-Aza处理 | 药物浓度：5 µM；处理时间：72小时；细胞系：AMC-HN-8和FD-LSC-1 阅读提示：Materials and methods - 5-Aza-2′-deoxycytidine treatment; Results - Figure 2E |
| 转染 | 质粒浓度：1.5 µg/ml；siRNA浓度：37.5 nM；转染试剂：Lipofectamine 3000；细胞汇合度：70-80%；分析时间：24小时 阅读提示：Materials and methods - Plasmids and small interfering RNAs |
| 体外功能实验 | CCK8：细胞数量4000/孔，检测时间0、24、48、72、96小时；集落形成：1000细胞/孔，培养10-14天，集落定义>50细胞；Transwell：迁移8×10^5 cells/ml，侵袭10×10^5 cells/ml，孵育48小时，计数8个视野 阅读提示：Materials and methods - CCK8 assay; colony formation assay; Transwell assays; Figure legends 3和4 |
| Western blot | 蛋白上样量：30-60 µg；抗体浓度：Flag 1:1000, JAM3 1:1000, LATS1 1:1000, p-LATS1 1:5000, YAP1 1:5000, p-YAP1 1:1000, β-actin 1:2000；封闭：10%脱脂奶粉 阅读提示：Materials and methods - Western blot analysis; Figure 5A |
| 体内实验 | 小鼠：6只SPF级雌性BALB/c裸鼠，4-6周龄；细胞注射：5×10^6 AMC-HN-8细胞皮下注射双侧胁部；siRNA处理：0.1 µg/µl，100 µl/次，隔日一次共7次；肿瘤体积公式=(length × width^2)/2 阅读提示：Materials and methods - In vivo assay; Results - JAM3 knockdown enhances; Figure 6 |