转录组测序及差异表达分析
筛选牦牛隐睾中差异表达的LncRNA、mRNA和miRNA，并鉴定与昼夜节律相关的候选基因。
对正常睾丸和隐睾组织进行LncRNA-seq、mRNA-seq和miRNA-seq，通过生物信息学分析鉴定差异表达转录本，并进行GO和KEGG富集分析，筛选出NTRK2及ceRNA网络。
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LncRNA-MSTRG.19083.1作为miR-429-y的海绵靶向NTRK2通过cAMP通路调控牦牛睾丸和隐睾的昼夜节律
LncRNA-MSTRG.19083.1 Targets NTRK2 as a miR-429-y Sponge to Regulate Circadian Rhythm via the cAMP Pathway in Yak Testis and Cryptorchidism.
实验完整度
中包含转录组测序、qRT-PCR、Western blot、免疫组化、免疫荧光、双荧光素酶报告实验和细胞转染，但缺乏体内动物实验和NTRK2敲低验证，故完整度中等。
主要模型
牦牛睾丸组织（正常和隐睾） 牦牛原代Leydig细胞 293T细胞
重点核对
样本来源：牦牛睾丸和隐睾组织各3例，来自甘肃省武威市，4岁。 细胞转染：牦牛Leydig细胞转染miR-429-y mimic/inhibitor（100 nM）及相应NC，时间为48小时。 双荧光素酶报告实验：293T细胞共转染pmirGLO-LncRNA/NTRK2 3'UTR-WT/MUT（400 ng）和miR-429-y mimic/NC（100 nM）。 核心检测指标：NTRK2、CREB、CLOCK、BMAL1的mRNA和蛋白表达变化。
摘要
长链非编码RNA（LncRNA）在哺乳动物的众多生物过程中发挥重要作用，如生殖生理学和内分泌学。隐睾是一种常见的雄性生殖疾病。昼夜节律在生殖系统中活跃表达。在本研究中，从牦牛睾丸和隐睾中获得了总共191个LncRNA。然后，我们确定了NTRK2与昼夜节律和行为过程的关系。同时，构建了ceRNA（LncRNA-MSTRG.19083.1/miR-429-y/NTRK2）网络，并揭示了其对昼夜节律的影响。结果表明，NTRK2和LncRNA-MSTRG.19083.1在隐睾组织中显著上调，而miR-429-y明显下降；NTRK2蛋白主要分布于睾丸间质细胞。此外，miR-429-y表达水平的上调导致LncRNA和NTRK2水平显著下调，而CREB、CLOCK和BMAL1的mRNA和蛋白水平显著上调；敲低miR-429-y则产生相反的变化。我们的发现表明，LncRNA-MSTRG.19083.1竞争性结合miR-429-y以靶向NTRK2，通过cAMP通路调节昼夜节律。总之，我们的研究结果提供了对牦牛隐睾发生时LncRNA-miRNA-mRNA网络如何运作的全面理解。了解与昼夜节律相关的mRNA和LncRNA可能有助于更好地理解昼夜节律与生殖之间的关系。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探究LncRNA-MSTRG.19083.1是否通过海绵吸附miR-429-y靶向NTRK2，并经cAMP通路调控牦牛隐睾中的昼夜节律。
- 核心机制
- LncRNA-MSTRG.19083.1作为miR-429-y的竞争性内源RNA（ceRNA），解除miR-429-y对NTRK2的抑制，上调NTRK2表达，进而激活cAMP信号通路，上调CREB、CLOCK和BMAL1的表达，从而影响昼夜节律。
- 主要证据
- RNA-seq筛选出NTRK2和LncRNA-MSTRG.19083.1在隐睾中上调，miR-429-y下调；荧光素酶报告实验证实miR-429-y直接靶向NTRK2和LncRNA-MSTRG.19083.1的3'UTR；在牦牛Leydig细胞中过表达miR-429-y下调NTRK2和LncRNA，上调CREB、CLOCK和BMAL1，抑制miR-429-y则相反。
- 研究意义
- 为理解牦牛隐睾发生过程中LncRNA-miRNA-mRNA网络的调控机制提供依据，并揭示了昼夜节律相关分子在生殖调控中的潜在作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异表达验证
通过qRT-PCR验证测序结果的可靠性。
随机选取10个LncRNA、8个miRNA和10个mRNA进行qRT-PCR检测，确认其在睾丸和隐睾组织中的表达趋势与测序一致。
NTRK2表达和定位分析
验证NTRK2在隐睾中的表达变化及其细胞定位。
使用qRT-PCR和Western blot检测NTRK2的mRNA和蛋白水平，通过H&E染色观察组织形态，免疫组化和免疫荧光检测NTRK2蛋白在睾丸和隐睾组织中的分布。
靶向关系验证
验证miR-429-y与NTRK2及LncRNA-MSTRG.19083.1的直接靶向关系。
通过TargetScan和miRanda预测结合位点，构建NTRK2和LncRNA-MSTRG.19083.1 3'UTR的野生型和突变型荧光素酶报告质粒，在293T细胞中共转染miR-429-y mimic或NC，检测荧光素酶活性。
细胞功能验证
探究miR-429-y对LncRNA-MSTRG.19083.1、NTRK2及昼夜节律相关基因表达的影响。
在牦牛原代Leydig细胞中转染miR-429-y mimic或inhibitor以及相应NC，通过qRT-PCR和Western blot检测miR-429-y、LncRNA-MSTRG.19083.1、NTRK2、CREB、CLOCK和BMAL1的表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | Trlquick试剂 | Solarbio | R1100 |
| TransZol Up试剂 | Invitrogen | -- | |
| cDNA合成 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Evo M-MLV逆转录试剂盒（含gDNA Clean）或miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | Accurate Biology | -- | |
| qPCR | TransStart TOP Green qPCR SuperMix | TRANS | -- |
| LightCycler 96实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 免疫组化 | HistostainTM-Plus试剂盒 | Bioss Biotechnology | -- |
| DAB显色试剂盒 | Bioss Biotechnology | -- | |
| ABC染色系统 | BOSTER | -- | |
| 免疫荧光 | 自发荧光淬灭剂 | Servicebio | -- |
| 细胞培养 | Percoll分离液 | Biosharp | BS909-100 |
| IV型胶原酶 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 双荧光素酶报告实验 | pmirGLO克隆载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告分析试剂盒 | Promega | -- | |
| Western blot | 细胞裂解液 | Solarbio | R0010 |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗NTRK2抗体 | Proteintech | 13129-1-AP | |
| 抗CREB抗体 | Proteintech | 12208-1-AP | |
| 抗BMAL1抗体 | Proteintech | 14268-1-AP | |
| 抗CLOCK抗体 | Abcam | ab3517 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Bioss | -- | |
| Image-Pro Plus 6.0软件 | -- | -- | |
| 荧光显微镜观察 | Olympus DP73光学显微镜 | Olympus | -- |
| 免疫荧光 | LSM800共聚焦显微镜 | ZEISS | -- |
| 免疫组化/免疫荧光 | MvImage软件 | Sunny | v3.1 |
| 抗体 | 抗HSD3β抗体 | -- | -- |
| β-微管蛋白抗体 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab169347 |
| DAPI染液 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Solarbio | A8010 | |
| 细胞培养 | miR-429-y模拟物 | Sangon Biotech | -- |
| 模拟物阴性对照 | Sangon Biotech | -- | |
| miR-429-y抑制剂 | Sangon Biotech | -- | |
| 抑制剂阴性对照 | Sangon Biotech | -- | |
| qPCR | 通用反向引物 | -- | -- |
| RNA质量控制 | NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | 样本来源、样本量、动物年龄、采集方法。 阅读提示：详见Materials and Methods 3.1 Sample Preparation and Collection。 |
| 转录组测序 | 测序平台、差异表达筛选阈值（fold change和FDR）。 阅读提示：详见3.2 Transcriptome Sequencing and Bioinformatics Analysis。 |
| qRT-PCR | 引物序列、退火温度、内参基因。 阅读提示：详见Table 1和3.3 RNA Isolation, cDNA Synthesis, and qRT-PCR。 |
| 细胞转染 | 细胞类型、转染试剂、mimic/inhibitor浓度、转染时间、细胞密度。 阅读提示：详见3.7 Cell Culture and Transfection。 |
| 双荧光素酶报告实验 | 报告质粒类型、共转染浓度、细胞系、检测时间。 阅读提示：详见3.8 Dual-Luciferase Reporter Assays。 |
| Western blot | 抗体信息、稀释比例、蛋白上样量。 阅读提示：详见3.9 Western Blot。 |