诱导HUVECs复制性衰老
建立不同衰老阶段的细胞模型，以研究FGF21反应性的变化。
通过连续传代培养HUVECs至PDL8、12、18、28、40，分别代表S1-S5阶段。
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ADAM10介导的β-klotho降解：衰老血管内皮细胞中FGF21抵抗的关键
ADAM10-mediated β-klotho degradation: a key to FGF21 resistance in senescent vascular endothelial cells.
实验完整度
高包含体外细胞模型（HUVECs年轻与衰老）、体内小鼠模型（年轻与老年小鼠主动脉），结合转录组、Western blot、qPCR、免疫组化、Co-IP、siRNA敲低及过表达等功能验证和机制研究。
主要模型
人脐静脉内皮细胞（HUVECs） 年轻（PDL8-12）与衰老（PDL27-30）HUVECs C57BL/6J小鼠（12周龄年轻与96周龄老年）
重点核对
HUVECs的传代次数（PDL）用于诱导复制性衰老，关键阶段为PDL8-12（年轻）和PDL27-30（衰老）。 FGF21处理浓度：生理浓度400 pg/mL，药理浓度5 ng/mL。 ADAM10 siRNA敲低效率及β-klotho过表达验证。 小鼠周龄：年轻12周，老年96周，用于主动脉组织分析。 qPCR验证基因：CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL8及MRPL1, MRPL13, MRPL47, MRPL48, MRPL54, MRPS6
摘要
成纤维细胞生长因子21（FGF21）是代谢和心血管健康的关键调节因子。然而，其在衰老和年龄相关疾病中的上调提示存在FGF21抵抗。本研究旨在阐明人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中衰老相关FGF21抵抗的机制，并探索潜在的治疗干预。转录组分析显示，与年轻细胞相比，衰老HUVECs中FGF21调节的基因数量显著减少，表明FGF21抵抗的发生。在年轻HUVECs中，FGF21抑制炎症细胞因子并上调线粒体核糖体蛋白基因。相反，衰老HUVECs中β-klotho（FGF21的必需辅助受体）在细胞膜上的表达下调，同时ADAM10（一种参与β-klotho降解的蛋白酶）表达上调。这些变化也在老年小鼠主动脉中观察到。ADAM10被证明可直接结合β-klotho并促进其降解，导致FGF21抵抗。抑制ADAM10或过表达β-klotho可恢复衰老HUVECs中FGF21的反应性。此外，药理浓度的FGF21可有效克服抵抗，恢复其对衰老细胞的调节作用。这些发现表明，ADAM10介导的β-klotho降解是FGF21抵抗发展的核心机制，靶向ADAM10/β-klotho轴可能代表恢复FGF21敏感性的新型治疗策略。药理学给予FGF21可能有望治疗血管衰老及其相关的心血管病理。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 衰老血管内皮细胞中FGF21抵抗的潜在机制是什么？
- 核心机制
- 衰老内皮细胞中ADAM10上调，通过直接结合并降解膜上的β-klotho，导致FGF21信号减弱，引发FGF21抵抗。
- 主要证据
- 通过转录组分析发现衰老HUVECs中FGF21调节基因减少；Western blot显示衰老细胞膜β-klotho蛋白降低，ADAM10升高；Co-IP和分子对接验证ADAM10与β-klotho相互作用；siRNA敲低ADAM10或过表达β-klotho恢复FGF21反应性。
- 研究意义
- 靶向ADAM10/β-klotho轴可能成为恢复FGF21敏感性、治疗血管衰老及相关心血管疾病的新型治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析
比较年轻和衰老HUVECs中FGF21调控的基因差异，识别FGF21抵抗的证据。
对年轻和衰老HUVECs进行RNA-seq，有无FGF21处理（400 pg/mL），分析差异表达基因。
验证衰老相关FGF21抵抗
验证衰老HUVECs中FGF21对靶基因（炎症因子和MRP基因）的调节作用减弱。
用qPCR检测年轻和衰老HUVECs中FGF21（400 pg/mL）对6个细胞因子和6个MRP基因表达的影响。
探究β-klotho表达变化
确定衰老HUVECs中β-klotho蛋白水平是否降低以及其定位变化。
通过Western blot检测年轻和衰老HUVECs中β-klotho的总蛋白、膜蛋白和胞浆蛋白水平，同时检测mRNA水平。
体内验证（小鼠模型）
验证衰老小鼠主动脉中β-klotho和ADAM10表达变化及其与FGF21抵抗的关联。
使用年轻（12周）和老年（96周）小鼠，检测主动脉PWV、血浆FGF21和β-klotho水平，并通过免疫组化检测主动脉组织β-klotho和ADAM10表达。
机制验证：ADAM10与β-klotho的相互作用
证明ADAM10直接结合β-klotho并促进其降解。
通过分子对接预测结合，Co-IP验证相互作用，siRNA敲低ADAM10检测β-klotho蛋白水平及细胞上清中的β-klotho浓度。
功能恢复实验
评估抑制ADAM10或过表达β-klotho是否能恢复衰老HUVECs对FGF21的反应性。
在衰老HUVECs中敲低ADAM10或过表达β-klotho，然后用FGF21（400 pg/mL）处理，检测下游基因表达。
评估药理浓度FGF21效果
确定高浓度FGF21能否克服衰老细胞的抵抗。
用5 ng/mL FGF21处理衰老HUVECs，检测SA-β-gal染色及基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞培养与衰老诱导
蛋白定量检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 重组FGF21 | Cranbury, USA | -- |
| 牛血清白蛋白 | Invitrogen | -- | |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| RNA提取 | HI Pure RNA提取试剂盒 | Magen | -- |
| RNA测序 | BGISEQ-500测序平台 | BGI | -- |
| Western blot | 膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0033 |
| 抗p21抗体 | Proteintech | 10355-1-AP | |
| 抗β-klotho抗体 | Abcam | ab106794 | |
| 抗ADAM10抗体 | Proteintech | 25900-1-AP | |
| 抗ADAM17抗体 | baijia | IPB2121 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗Na+/K+-ATPase抗体 | Abcam | ab76020 | |
| RT-qPCR | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| HiPure RNA试剂盒 | Magen | -- | |
| Step-One-Plus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| SYBR Green荧光染料 | TOYOBO | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| 过表达构建 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 衰老检测 | 衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Abbkine Scientific | -- |
| ELISA | β-klotho ELISA试剂盒 | Boster Biological Technology | EK1492 |
| 小鼠FGF21 ELISA试剂盒 | RUIXIN BIOTECH | RX203011M | |
| 小鼠β-klotho ELISA试剂盒 | RUIXIN BIOTECH | RX2D227766 | |
| Co-IP | 蛋白酶抑制剂 | MERCK | 4693132001 |
| Western和IP裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013 | |
| 蛋白A/G磁珠 | Bio-Rad | #161-4013/#161-4023 | |
| 抗ADAM10抗体 | HUABIO | ET1703-60 | |
| 兔IgG | Beyotime Biotechnology | A7016 | |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| Vevo 2100小动物超声成像系统 | VisualSonics | -- | |
| 免疫组化 | 抗KLB抗体 | Abcam | ab106794 |
| 抗ADAM10抗体 | Proteintech | 25900-1-AP | |
| 抗p16抗体 | Proteintech | 10883-1-AP | |
| 抗SIRT1抗体 | Bioss | bs-0921R |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与衰老诱导 | HUVECs的传代次数（PDL）和培养条件，包括培养基、血清浓度、饥饿处理时间。 阅读提示：见Methods 'Endothelial cell culture and treatments' |
| FGF21处理 | FGF21的浓度（400 pg/mL 或 5 ng/mL）和处理时间（48小时） 阅读提示：见Methods 'Endothelial cell culture and treatments' 和 Results 'Restoring responsiveness' |
| 转录组分析 | RNA提取试剂盒、测序平台、样本量和差异表达基因筛选阈值（|log2FC|>0, q<0.05） 阅读提示：见Methods 'RNA sequencing' 和 'RNA-seq' |
| Western blot | 抗体信息（β-klotho, ADAM10等）、蛋白提取试剂盒、内参选择（GAPDH, Na+/K+-ATPase） 阅读提示：见Methods 'Western blot assays' |
| siRNA干扰和过表达 | siRNA序列、转染试剂、转染时间、细胞汇合度、MOI值、筛选抗生素浓度 阅读提示：见Methods 'siRNA interference and cell transfection' 和 'Construction of the KLB overexpression lentiviral model' |
| 动物实验 | 小鼠品系、周龄（年轻12周、老年96周）、样本量（n=4 or 5）、麻醉和安乐死方法、PWV测量方法 阅读提示：见Methods 'Animals, vascular stiffness evaluation, and tissue collections' |
| ELISA检测 | ELISA试剂盒（β-klotho）及样本类型（细胞上清、血浆） 阅读提示：见Methods 'Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)' |