缺氧条件促进iPSC生成及BRG1表达
比较常氧与缺氧条件下iPSC生成效率及BRG1和糖酵解相关基因的表达，探索潜在调控因子。
在常氧（20% O2）和缺氧（5% O2）条件下诱导PFFs重编程，检测AP阳性克隆数、多能性及糖酵解基因表达、BRG1表达。
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BRG1通过增强糖酵解代谢提高重编程效率
BRG1 improves reprogramming efficiency by enhancing glycolytic metabolism.
实验完整度
高包含体外细胞培养、iPSC诱导、EdU增殖检测、糖酵解压力测试、LC-MS代谢组学、ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因、Western blot等实验，并进行了功能验证（过表达/抑制剂）和机制验证（通路抑制剂及挽救实验）。
主要模型
猪胎儿成纤维细胞（PFFs） 293T细胞 猪iPSCs
重点核对
猪胎儿成纤维细胞（PFFs）来源及培养条件 iPSC诱导培养基成分及DOX、bFGF、LIF等添加物 BRG1过表达和抑制剂（PFI-3）处理浓度和时间 PI3K/AKT抑制剂LY294002处理浓度和时间 2-DG添加浓度和时间
摘要
BRG1已被发现通过调节表观遗传修饰或结合转录因子促进诱导多能干细胞（iPSCs）的产生，然而，BRG1在重编程过程中对细胞代谢的作用尚未见报道。在本研究中，我们发现BRG1提高了猪iPSC生成的效率，并上调了多能性相关因子的表达。进一步分析显示，BRG1促进了细胞糖酵解，并增加了糖酵解相关代谢物的水平。它增强了糖酵解相关基因HK2、PKM2和PFK-1启动子的转录活性，并减少了糖酵解和多能性相关基因启动子中H3K9me3的富集。BRG1还增加了AKT蛋白Ser473位点的磷酸化水平。特异性PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002损害了猪iPSCs的生成，下调了多能性相关因子的表达，并抑制了细胞糖酵解，而过表达BRG1则挽救了LY294002处理引起的这些变化。此外，糖酵解抑制剂2-DG和BRG1抑制剂PFI-3具有与LY294002相似的作用。上述结果表明，BRG1的过表达通过PI3K/AKT信号通路促进糖酵解重编程，从而促进猪iPSCs的生成。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BRG1在猪体细胞重编程过程中的能量代谢调控作用及其机制。
- 核心机制
- BRG1通过激活PI3K/AKT信号通路，增强糖酵解代谢，同时提高糖酵解相关基因（HK2、PKM2、PFK-1）的转录活性并降低其启动子区H3K9me3富集，从而促进猪iPSC的生成。
- 主要证据
- 过表达BRG1提高AP阳性克隆数、多能性基因表达和糖酵解水平；LY294002抑制PI3K/AKT通路后损害重编程和糖酵解，而BRG1过表达可挽救；ChIP-qPCR显示BRG1富集于糖酵解基因启动子，降低H3K9me3；双荧光素酶报告基因显示增强启动子活性。
- 研究意义
- 本研究首次报道BRG1在体细胞重编程过程中调节能量代谢，为深入理解代谢重编程的调控机制提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
BRG1过表达对iPSC生成的影响
验证BRG1过表达是否提高猪iPSC生成效率及多能性相关基因表达。
用慢病毒载体（OSKM和BRG1）感染PFFs，检测细胞增殖率、AP阳性克隆数、多能性基因和蛋白表达。
BRG1增强糖酵解代谢
探究BRG1对重编程过程中细胞糖酵解水平的影响。
检测糖酵解相关基因表达、细胞外酸化率（ECAR）、细胞内葡萄糖和乳酸水平、代谢组学分析。
抑制糖酵解对iPSC生成的影响
验证糖酵解对重编程的必要性。
使用2-DG抑制糖酵解，检测iPSC生成效率、多能性及糖酵解基因表达。
BRG1对启动子活性和表观遗传修饰的影响
探究BRG1是否调控糖酵解相关基因启动子的转录活性和H3K9me3修饰。
ChIP-qPCR检测BRG1和H3K9me3在启动子区的富集，双荧光素酶报告基因检测启动子活性。
PI3K/AKT通路在BRG1促进重编程中的作用
验证BRG1是否通过PI3K/AKT信号通路促进糖酵解和重编程。
使用LY294002抑制PI3K/AKT，检测iPSC生成、多能性基因、糖酵解指标，并观察BRG1过表达是否挽救。
BRG1抑制对重编程的影响
验证BRG1缺失是否抑制iPSC生成和糖酵解。
使用PFI-3抑制BRG1，检测iPSC生成效率、多能性、p-AKT和糖酵解相关基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 2-脱氧葡萄糖 | MCE | -- | |
| iPSC诱导 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| 人白血病抑制因子 | -- | -- | |
| 药物处理 | PFI-3 | Aladdin | -- |
| LY294002 | Beyotime | -- | |
| AP染色 | 碱性磷酸酶检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 免疫荧光 | H3K9me3抗体 | Abclonal | A22295 |
| 5-甲基胞嘧啶抗体 | CST | #28692 | |
| DAPI | -- | -- | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| HiScript III逆转录预混液 | Vazyme | -- | |
| ChamQ通用型SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| Western blot | BRG1抗体 | CST | #49360 |
| HIF1A抗体 | Wanleibio | WL01607 | |
| PKM2抗体 | Servicebio | GB11392 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Abclonal | AC038 | |
| LDHA抗体 | Servicebio | GB11342 | |
| OCT4抗体 | CST | #2750 | |
| NANOG抗体 | Bioss | bs-0829R | |
| p-AKT (Ser473)抗体 | Proteintech | 66444-1-lg | |
| AKT抗体 | Abmart | TP70420 | |
| EdU检测 | beyoClick™ EdU细胞增殖试剂盒 | Beyotime | -- |
| 糖酵解压力测试 | Seahorse XFe24细胞外流量分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| 糖酵解压力测试试剂盒 | Agilent | -- | |
| 代谢物检测 | 乳酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng BioTech. Co. Ltd | -- |
| 葡萄糖检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng BioTech. Co. Ltd | -- | |
| 超声波细胞破碎仪 | Scientz | -- | |
| 酶标仪 | Tecan | -- | |
| ChIP-qPCR | EpiQuik™染色质免疫沉淀试剂盒 | Epigentek | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| 代谢组学 | 超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白印迹 | ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- |
| 细胞培养 | ExFect转染试剂 | Vazyme | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | PFFs来源、培养条件（培养基、血清浓度、温度、CO2浓度） 阅读提示：Materials and methods, Cell culture |
| iPSC诱导 | 慢病毒载体（OSKM和BRG1）及包装质粒、感染条件（polybrene浓度、感染时间）、诱导培养基组成（DOX、bFGF、LIF等）、氧气浓度（20%和5%） 阅读提示：Materials and methods, Porcine iPSC generation |
| 药物处理 | 2-DG浓度（5 mM）和添加时间（第6天）、LY294002浓度（10 μM）、PFI-3浓度（1 μM）及处理时间（感染前24小时） 阅读提示：Materials and methods, Porcine iPSC generation |
| 糖酵解检测 | Seahorse分析条件（细胞密度、培养基、药物添加顺序和浓度）、细胞内葡萄糖乳酸检测波长（530nm和505nm） 阅读提示：Materials and methods, Glycolysis stress tests, Intracellular lactate and glucose detection |
| ChIP-qPCR | 交联时间、超声破碎条件、抗体、免疫沉淀时间、洗涤次数 阅读提示：Materials and methods, Chromatin immunoprecipitation (ChIP)-qPCR |