SMARCA4缺失细胞系的建立与验证
获得SMARCA4功能缺失的细胞模型，以研究其对免疫信号的影响。
使用CRISPR-Cas9基因编辑技术在小鼠（ID8、UPK10）和人（OAW28）卵巢癌细胞系中敲除SMARCA4，并通过单细胞克隆筛选；同时使用shRNA在B16-F10细胞中敲低SMARCA4。通过Sanger测序、Western blot和免疫荧光验证敲除效果。
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SMARCA4突变驱动的干扰素反应和表观遗传调控增强卵巢肿瘤免疫原性
Interferon response and epigenetic modulation by SMARCA4 mutations drive ovarian tumor immunogenicity.
实验完整度
高包含体外细胞模型（CRISPR敲除、siRNA敲低、药理学抑制）、体内小鼠模型（同系移植瘤、免疫缺陷RAG2-/-小鼠）、ATAC-seq、RNA-seq等多层次验证，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
ID8小鼠卵巢癌细胞系 UPK10小鼠卵巢癌细胞系 OAW28人卵巢癌细胞系 B16-F10小鼠黑色素瘤细胞系 C57BL/6小鼠同系移植瘤模型 RAG2-/-小鼠模型
重点核对
SMARCA4敲除或敲低方法（CRISPR-Cas9或shRNA）及克隆选择 细胞系来源和培养条件（如ID8、UPK10、OAW28、B16-F10） 体内模型：细胞接种数量、途径（腹腔或皮下）、时间点 BRG1抑制剂处理浓度、时间及给药方式 信号通路依赖验证（STING、MAVS、IRF3）
摘要
卵巢癌（OC）免疫原性的细胞内在机制尚不清楚。SWI/SNF染色质重塑复合物的破坏性突变，如SMARCA4（BRG1），与免疫检查点阻断治疗反应的改善相关；然而，其机制尚不清楚。我们发现在OC模型中SMARCA4缺失导致癌细胞内在免疫原性增强，其特征是长末端重复RNA序列上调、干扰素刺激基因表达增加以及抗原呈递机制上调。值得注意的是，这种反应依赖于STING、MAVS和IRF3信号传导，但不依赖于I型干扰素受体。SMARCA4缺失的小鼠卵巢癌和黑色素瘤肿瘤表现出肿瘤微环境中细胞毒性T细胞、NK细胞和髓系细胞浸润和激活的增加。这些结果在BRG1抑制剂处理的SMARCA4正常肿瘤模型中得到重现，表明通过靶向SMARCA4调节染色质重塑可能作为克服癌症免疫逃逸的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SMARCA4功能缺失如何通过细胞内在机制增强卵巢癌的免疫原性？
- 核心机制
- SMARCA4缺失导致转座元件（特别是LTR）表达增加和dsRNA形成，激活MAVS和STING信号通路，进而通过IRF3上调ISGs和抗原呈递机制，增强肿瘤免疫原性。
- 主要证据
- RNA-seq、qRT-PCR、ATAC-seq、Western blot、免疫荧光和流式细胞术等实验证明了上述机制；体内小鼠模型显示SMARCA4缺失或BRG1抑制后肿瘤生长减缓、免疫细胞浸润增加。
- 研究意义
- 研究为SMARCA4突变作为免疫治疗反应预测生物标志物提供依据，并支持靶向BRG1作为增强肿瘤免疫原性的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组和表观遗传分析
鉴定SMARCA4缺失引起的基因表达和染色质可及性变化。
对sgSMARCA4和sgNTC细胞进行RNA-seq和ATAC-seq，分析差异表达基因、通路富集、转座子表达和染色质可及性变化。
验证信号通路依赖性
确定SMARCA4缺失诱导的ISG上调所依赖的信号通路。
使用中和抗体阻断IFNAR，通过shRNA敲低IRF3和MAVS，或通过CRISPR敲除STING，检测ISG表达变化；使用ATAC-seq和ChIP-Atlas分析IRF3结合位点。
体外功能验证
评估SMARCA4缺失对癌细胞免疫原性的影响。
通过流式细胞术检测MHC1和PD-L1表达，通过免疫荧光检测dsRNA形成，通过qRT-PCR检测ISGs和ERVs表达。
体内免疫反应评估
验证SMARCA4缺失或BRG1抑制对肿瘤生长和免疫微环境的影响。
将sgSMARCA4或shSMARCA4肿瘤细胞接种于小鼠（C57BL/6或RAG2-/-），通过流式细胞术分析免疫细胞浸润和激活，通过生物发光成像或卡尺测量肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因编辑与细胞系构建
免疫表型分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| G418 | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| 基因编辑 | pLentiCRISPR v2载体 | Addgene | 52961 |
| px459载体 | -- | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| 聚凝胺 | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| 质粒转染培养基 | Santa Cruz Biotechnology | SC-10862 | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| 测序 | RNeasy小型试剂盒 | QIAGEN | 74104 |
| DNeasy血液和组织试剂盒 | QIAGEN | 69504 | |
| Tn5转座酶 | Illumina | 20034198 | |
| ThruPLEX DNA测序试剂盒 | Takara Bio | R400676 | |
| qRT-PCR | Superscript VILO预混液 | Thermo Fisher Scientific | 11755050 |
| TaqMan通用预混液II（含UNG） | Thermo Fisher Scientific | 4440044 | |
| PowerUp SYBR Green | Thermo Fisher Scientific | A25776 | |
| StepOnePlus实时PCR系统 | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 测序 | AmpliTaq Gold 360预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4398886 |
| ExoSAP-IT PCR产物纯化试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78200 | |
| 蛋白质分析 | 抗MAVS抗体 | Bioss | BS-4053R |
| 抗IRF3抗体 | Invitrogen | MA5-32348 | |
| 抗BRG1抗体 | Cell Signaling Technology | 49360 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2144S | |
| 抗纽蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-73614 | |
| iBright成像系统 | Invitrogen | FL1500 | |
| 免疫荧光 | 4%甲醛 | Thermo Fisher Scientific | 28908 |
| 正常山羊血清 | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | |
| 含DAPI的ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36930 | |
| 全景扫描仪 | 3DHistech | -- | |
| J2抗dsRNA抗体 | Jena Bioscience | RNT-SCI-10010200 | |
| Alexa Fluor 555标记麦胚凝集素染料 | Thermo Fisher Scientific | W32464 | |
| Alexa Fluor 488抗小鼠IgG2a抗体 | BioLegend | 407121 | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂和DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36941 | |
| Zeiss LSM780共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 核糖核酸酶III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| 流式细胞术 | 活力染料 | Thermo Fisher Scientific | L34966 |
| Brilliant染色缓冲液 | BD Biosciences | 563794 | |
| 转录因子染色缓冲液套装 | Thermo Fisher Scientific | 00-5523-00 | |
| Cytek Aurora光谱流式细胞仪 | Cytek Biosciences | -- | |
| BD FACSAria II细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| NxT Attune流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 药物处理 | BRG1/BRM抑制剂 | MedChemExpress | HY-119374 |
| BRG1/BRM蛋白降解靶向嵌合体 | Prelude Therapeutics | PRTD-0043 | |
| 重组小鼠IFN-α | PBL Assay Science | 12100-1 | |
| 人IFN-α | PBL Assay Science | 11100-1 | |
| 抗人IFNAR2抗体 | PBL Assay Science | 21385-1 | |
| 抗小鼠IFNAR-1抗体 | BioXCell | BE0241 | |
| 重组IFN-β | PeproTech | 300-02 BC | |
| 聚肌胞苷酸 | InvivoGen | tlrl-picw | |
| 鲑鱼精DNA | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| 动物实验 | C57BL/6小鼠 | The Jackson Laboratory | -- |
| B6(Cg)-Tyrc-2J/J小鼠 | The Jackson Laboratory | -- | |
| RAG2-/-小鼠 | -- | -- | |
| IVIS Spectrum小动物活体成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| 细胞培养 | 通用支原体检测试剂盒 | ATCC | 30-1012K |
| DAPI | -- | -- | |
| 流式细胞术 | Percoll分离液 | -- | -- |
| ACK裂解缓冲液 | Gibco | A1049201 | |
| Liberase酶 | Sigma-Aldrich | 5401020001 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | 10104159001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系构建与培养 | 细胞系来源、培养基成分、筛选药物浓度（嘌呤霉素或遗传霉素）、SMARCA4敲除方法及克隆选择 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines, SMARCA4-knockout cell line establishment |
| 基因表达和信号通路分析 | RNA-seq和ATAC-seq实验条件、抗体克隆号、IFNAR阻断抗体浓度和处理时间 阅读提示：Materials and Methods: RNA-sequencing analyses, ATAC-seq and epigenome analyses, Protein analyses |
| 体外药物处理 | BRG1/BRM抑制剂浓度（1 μM）和处理时间（48小时） 阅读提示：Materials and Methods: Treatments |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系、年龄、性别、细胞接种数量和途径（腹腔或皮下）、肿瘤测量时间点 阅读提示：Materials and Methods: In vivo studies |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号、染色时间、裂解和消化条件、仪器设置 阅读提示：Materials and Methods: Flow cytometry |