细胞骨架调节蛋白哺乳动物Enabled蛋白(Mena)在HPV16相关口腔鳞状细胞癌侵袭和转移中的作用

The Role of the Cytoskeletal Regulatory Protein, Mammalian Enabling Protein (Mena), in Invasion and Metastasis of HPV16-Related Oral Squamous Cell Carcinoma.

作者信息Zhichen Guo, Linyang Xie, Hao Cui, Xin Yang, Hong Qi, Ming Yu, Yuxin Gong, Junbo Tu, Sijia Na
PMID39682720
期刊Cells
发布时间2024-11-28
DOI10.3390/cells13231972

实验完整度

包含生物信息学分析、临床样本IHC、细胞功能实验、Western blot及体内动物模型,且明确进行功能验证和机制验证。

主要模型

HPV16阴性OSCC细胞系Cal27 HPV16阳性OSCC细胞系SCC090 免疫缺陷小鼠肝转移模型 OSCC患者组织样本

重点核对

Mena表达在HPV16阳性与阴性OSCC中的差异 Mena表达与淋巴转移及TNM分期的相关性 siMena敲低Cal27和LV-Mena过表达SCC090的转染效率 体内实验中免疫缺陷小鼠的尾静脉注射细胞量和观察时间 EMT相关蛋白E-cadherin、vimentin、MMP-2的表达变化

摘要

背景:本研究的目的是探讨哺乳动物Enabled蛋白(Mena)对HPV16相关口腔鳞状细胞癌(OSCC)侵袭和转移的影响及其潜在机制。材料与方法:从TCGA、GEO和TIMER数据库中分析了HPV相关OSCC中Mena基因的表达谱。采用免疫组织化学方法研究Mena以及侵袭和转移相关标志物的表达及其临床病理特征。通过未转染和稳定转染模型评估Mena在OSCC细胞系生物学行为中的作用,并在体外分析EMT相关标志物。通过免疫缺陷小鼠模型在体内评估Mena对HPV16相关OSCC转移的影响。结果:Mena表达在HPV16阳性OSCC中显著降低,且在HPV16阴性OSCC中Mena表达与淋巴转移、TNM分期以及E-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-2相关,但在HPV16阳性OSCC中无统计学显著性。在HPV16阴性OSCC患者中,Mena表达升高与较差的总生存期和无病生存期显著相关。Mena在促进OSCC细胞迁移、侵袭和转移中起重要作用。结论:Mena通过激活EMT过程促进HPV阴性OSCC的侵袭和转移。然而,在感染HPV16的OSCC中Mena表达受到抑制,从而抑制其侵袭和转移能力。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
HPV16感染如何通过调控Mena影响OSCC的侵袭和转移?
核心机制
Mena通过激活Snail和Slug转录促进EMT过程,上调MMP-2表达,从而促进OSCC侵袭和转移;HPV16感染抑制Mena表达,进而抑制该机制。
主要证据
在Cal27细胞中敲低Mena降低侵袭转移能力并伴随EMT标志物变化,在SCC090细胞中过表达Mena则增强侵袭转移;体内实验中siMena组肝转移灶减少,LV-Mena组增加。
研究意义
Mena可能作为HPV16相关OSCC的潜在预后生物标志物,并为HPV16相关OSCC的分子靶向治疗和免疫治疗提供理论基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

生物信息学分析Mena表达

分析Mena在不同HPV状态的OSCC中的表达差异

从TCGA、GEO和TIMER数据库获取数据,比较HPV阳性和阴性OSCC中Mena表达。

2

临床样本免疫组化分析

验证Mena蛋白表达与临床病理特征的关系

对130例OSCC组织进行IHC染色,评估Mena、P16、E-cadherin、vimentin、MMP-2表达,并分析其与临床因素的相关性。

3

细胞功能实验

评估Mena对OSCC细胞迁移和侵袭的影响

在Cal27细胞中敲低Mena,在SCC090细胞中过表达Mena,通过Transwell和划痕实验检测迁移和侵袭能力。

4

蛋白表达分析

验证Mena对EMT相关蛋白表达的影响

通过Western blot检测Mena、Snail、Slug、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、MMP-2的表达。

5

体内转移实验

验证Mena在体内对OSCC转移的影响

将不同处理的细胞注射到免疫缺陷小鼠尾静脉,4周后评估肝转移灶。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

数据库分析
临床样本分析
蛋白表达检测

产品清单

实验环节名称品牌货号
徕卡Bond MAXLeica Microsystems--
抗Mena抗体Abcamab244417
抗P16INK4A抗体Sanying10883-1-AP
抗E-钙黏蛋白抗体MaixinMAB-0738
抗波形蛋白抗体MaixinMAB-0735
抗MMP-2抗体Abcamab37150
Bond Polymer Refine-HRP检测试剂盒LeicaDS9800
DMEM培养基Gibco--
无外泌体胎牛血清----
siMena慢病毒Genechem--
LV-Mena慢病毒Genechem--
Transwell小室Corning--
Matrigel基底膜基质BD Biosciences--
倒置显微镜(奥林巴斯FSX100)Olympus--
RIPA裂解液试剂盒ZHHC--
BCA蛋白定量试剂盒BOSTER--
彩色凝胶快速制备试剂盒ZHHC--
PVDF膜----
抗P16INK4A抗体Sanying10883-1-AP
抗Mena抗体Abcamab244417
抗MMP-2抗体Abcamab37150
抗Snail+Slug抗体BIOSSbs-11961R
抗E-钙黏蛋白抗体BIOSSbs-1519R
抗N-钙黏蛋白抗体Abcamab37150
抗GAPDH抗体BOSTERBM3874
发光试剂BOSTERAR1197
Bio-Rad ChemiDoc XRS系统Bio-Rad--
SPSS统计软件24.0IBM--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系来源、培养基配方、培养条件(温度、CO2浓度)
阅读提示:Materials and Methods 2.4 Cell Culture and Cell Transfection
细胞转染
细胞密度、病毒使用量、感染时间、筛选药物浓度
阅读提示:Materials and Methods 2.4 Cell Culture and Cell Transfection
细胞侵袭和迁移实验
细胞数量、基质胶包被浓度、孵育时间、染色剂浓度
阅读提示:Materials and Methods 2.5 Cell Invasion and Migration Assays
蛋白表达检测
蛋白上样量、一抗稀释比例、孵育条件
阅读提示:Materials and Methods 2.7 Western Blotting
动物模型
小鼠品系、周龄、注射细胞数、观察时间、处死方式
阅读提示:Materials and Methods 2.8 In Vivo Experiments to Evaluate Tumour Metastasis