SCAPs的分离、培养和鉴定
获取并验证具有间充质干细胞特性的根尖乳头干细胞。
从青少年正畸拔牙的根尖乳头组织中分离SCAPs，进行三系分化（成骨、成脂、成软骨）鉴定和流式细胞术检测表面标记物（CD44、CD90、CD45、CD11）。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
根尖乳头干细胞来源的外泌体通过调节脂肪酸代谢和减轻炎症改善NASH
Exosomes derived from apical papilla stem cells improve NASH by regulating fatty acid metabolism and reducing inflammation.
实验完整度
高包含体内小鼠模型（HFD诱导的NASH）和体外细胞模型（OA/PA处理HepG2细胞）两个独立证据层级，并通过组织学、生化检测、Western blot、qPCR等验证功能与机制。
主要模型
HFD诱导的NASH小鼠模型（C57BL/6J小鼠） OA/PA处理的HepG2细胞模型 根尖乳头干细胞及其外泌体
重点核对
HFD喂养18周，最后6周尾静脉注射外泌体（50或100 μg/只），每周两次 HepG2细胞用0.5 mM OA和0.25 mM PA处理24小时，外泌体共孵育浓度100 μg/ml 检测肝组织HE染色、油红O染色、TG含量、血清ALT/AST、炎症因子（TNF-α, IL-6）水平 Western blot检测AMPK、p-AMPK、PPARα、CPT1α、SREBP1c、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达 qPCR检测脂肪酸氧化（PPARα, ACOX, CPT1α）、转运（FABP5）和合成（SREBP1c, FASN, ACACA）基因表达
摘要
背景：根尖乳头干细胞（SCAPs）在组织修复中显示出巨大潜力，具有抗炎和促血管生成的特性。干细胞来源的外泌体作为更安全的替代品，保留了相似的生理功能。本研究探讨了来源于SCAPs的外泌体在治疗非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中的治疗潜力。方法：通过给予高脂饮食（HFD）建立NASH小鼠模型，随后分离SCAPs用于实验。通过用油酸（OA）和棕榈酸（PA）处理肝癌细胞，在体外建立NASH细胞模型。通过差速离心法分离外泌体。小鼠通过尾静脉注射外泌体，肝细胞在体外与外泌体共孵育。实验结束后，分析生理和生化指标，以评估SCAPs来源的外泌体对NASH小鼠模型和NASH细胞模型中NASH进展的影响。结果：外泌体处理后，HFD诱导的体重增加和肝损伤显著减少。此外，肝脏脂肪积累明显减轻。机制上，外泌体处理促进了参与肝脏脂肪酸氧化和转运的基因表达，同时抑制了与脂肪酸合成相关的基因。此外，血清炎症细胞因子水平和肝组织中炎症标志物的mRNA表达显著降低。体外细胞实验产生了类似的结果。补充信息：在线版本包含补充材料，可在10.1186/s10020-024-00945-1获取。关键词：关键词：根尖乳头干细胞来源的外泌体，NASH，AMPK，PPARα
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 根尖乳头干细胞来源的外泌体是否能够改善非酒精性脂肪性肝炎（NASH），以及其潜在的作用机制是什么？
- 核心机制
- 外泌体通过激活AMPK磷酸化和PPARα表达，促进脂肪酸氧化和转运基因（如CPT1α、ACOX、FABP5）表达，抑制脂肪酸合成基因（如SREBP1c、FASN、ACACA）表达，同时抑制NF-κB磷酸化并可能促进巨噬细胞M2极化，从而减轻炎症。
- 主要证据
- HFD诱导的NASH小鼠模型和OA/PA处理的HepG2细胞模型中，外泌体处理显著减轻体重增加、肝损伤和脂质积累，降低血清炎症因子水平，并改变脂质代谢相关基因和蛋白的表达。
- 研究意义
- 研究提出SCAPs来源的外泌体可能作为治疗NASH的潜在治疗药物，其抗炎和脂肪酸代谢调节作用为NASH治疗提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
外泌体的分离与鉴定
从SCAPs条件培养基中提取并验证外泌体的特征。
收集P3-P6代SCAPs培养基，通过差速离心法提取外泌体，并用透射电镜、纳米粒子追踪分析（NTA）和Western blot检测外泌体标志物（TSG101、CD63、HSP70、Calnexin）。
体内NASH模型的建立与外泌体治疗
评估SCAPs来源外泌体对HFD诱导的NASH小鼠模型的治疗效果。
C57BL/6J小鼠随机分为4组（对照组、HFD组、HFD+外泌体50 μg组、HFD+外泌体100 μg组），HFD喂养18周，最后6周尾静脉注射PBS或外泌体，每周两次。记录体重、血糖、肝重，并进行肝组织学分析（HE染色、油红O染色）、血清ALT/AST和TG水平测定。
体外NASH模型的建立与外泌体治疗
验证外泌体对OA/PA诱导的HepG2细胞NASH模型的改善作用。
HepG2细胞分为对照组、OA/PA处理组（0.5 mM OA，0.25 mM PA）和OA/PA+外泌体（100 μg/ml）共孵育组，处理24小时。检测细胞脂质积累（油红O、尼罗红染色）、ROS水平、脂质代谢基因表达（qPCR）和蛋白表达（Western blot）。
脂质代谢和炎症机制的验证
阐明外泌体调节脂质代谢和炎症的分子机制。
通过Western blot和qPCR检测肝脏或细胞中AMPK、p-AMPK、PPARα、CPT1α、SREBP1c、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达以及脂质代谢相关基因（如PPARα、ACOX、CPT1α、FABP5、SREBP1c、FASN、ACACA）和炎症细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）mRNA表达，并检测M2巨噬细胞标志物（CD206、Arg-1、IL-10）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | α-MEM培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞分离 | I型胶原酶 | Solarbio | -- |
| 中性蛋白酶 | Solarbio | -- | |
| 细胞分化鉴定 | 油红O | Solarbio | -- |
| 茜素红S | Solarbio | -- | |
| 成软骨诱导完全培养基 | Procell | -- | |
| 细胞处理 | 油酸 | Kunchuang | -- |
| 棕榈酸 | Kunchuang | -- | |
| 根尖乳头干细胞来源的外泌体 | -- | -- | |
| 染色 | 尼罗红 | Solarbio | -- |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| ROS检测 | ROS荧光探针 | Beyotime | -- |
| 组织学分析 | OCT包埋剂 | Cervell | -- |
| 生化检测 | ALT/AST检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Solarbio | -- | |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | 4A Biotech | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | 4A Biotech | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| SDS-PAGE凝胶 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗AMPK抗体 | Cell Signaling Technology | 5831T | |
| 抗CPT1α抗体 | Immunoway | YN3388 | |
| 抗NF-κB抗体 | Cell Signaling Technology | 8242T | |
| 抗p-AMPK抗体 | Cell Signaling Technology | 2535T | |
| 抗p-NF-κB抗体 | Cell Signaling Technology | 3033T | |
| 抗PPARα抗体 | Immunoway | YT3835 | |
| 抗SREBP1c抗体 | Immunoway | YT6055 | |
| 抗β-actin抗体 | BIOSS | bs-0061R | |
| 抗Calnexin抗体 | Abcam | ab22595 | |
| 抗CD63抗体 | Abcam | ab134045 | |
| HRP标记二抗 | Immunoway | RS0002 | |
| 抗HSP70抗体 | Abcam | ab2787 | |
| 抗TSG101抗体 | Abcam | ab1225011 | |
| 流式细胞术 | 抗CD11抗体 | ThermoFisher | CD11B01 |
| 抗CD44抗体 | ThermoFisher | 11-0441-82 | |
| 抗CD45抗体 | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| 抗CD90抗体 | ThermoFisher | 11-0909-42 | |
| qPCR | TRIZOL试剂 | 文中未明确说明 | -- |
| 逆转录试剂盒 | Vazyme | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Vazyme | -- | |
| 动物实验 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SCAPs分离与培养 | 细胞来源（12-16岁青少年根尖乳头组织）、消化酶（3 mg/ml I型胶原酶和中性蛋白酶，37°C 40分钟）、培养基（α-MEM+10%FBS+1%双抗） 阅读提示：Methods: Isolation and culture of SCAPs |
| 外泌体分离与鉴定 | 差速离心条件（300g 10min, 2000g 10min, 10000g 30min, 100000g 70min）及外泌体标志物（TSG101、CD63、HSP70、Calnexin） 阅读提示：Methods: Exosomes isolation; Results: Fig.1 and corresponding figure legend |
| 动物模型建立与处理 | 小鼠品系（C57BL/6J）、性别（雄性）、周龄（5-6周）、体重（17-20g）、每组数量（6只）、HFD组成（40% kcal脂肪、20% kcal果糖、2% kcal胆固醇）、HFD持续时间（18周）、给药方式（尾静脉注射）、剂量（50或100 μg/只）、频率（每周两次，持续6周） 阅读提示：Methods: Animal treatment; Results: Fig.2 and corresponding figure legend |
| 体外细胞模型建立与处理 | 细胞系（HepG2）、OA/PA浓度（0.5 mM OA，0.25 mM PA）、外泌体浓度（100 μg/ml）、处理时间（24小时） 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment; Table 1 |
| 分子检测 | 抗体稀释度（见表3）、qPCR引物序列（见表4）、参考基因（GAPDH） 阅读提示：Methods: Western blotting; Quantitative real-time PCR measurements; Table 3; Table 4 |