获取临床样本并进行单细胞转录组测序
描绘PBC患者肝脏和外周血单个核细胞（PBMC）的免疫细胞图谱
对5例PBC患者和5例对照的肝脏及PBMC进行scRNA-seq，经质量控制、降维聚类，鉴定出22个肝脏细胞亚群和18个PBMC细胞亚群。
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单细胞RNA测序揭示原发性胆汁性胆管炎中肝脏驻留Th1样细胞的促炎作用
Single-cell RNA sequencing reveals the pro-inflammatory roles of liver-resident Th1-like cells in primary biliary cholangitis.
实验完整度
高包含scRNA-seq、流式细胞术、免疫荧光、免疫组化及动物模型等多层级验证，并进行了JAK-STAT通路抑制的功能实验。
主要模型
PBC患者肝组织及PBMC 2OA-BSA免疫小鼠PBC模型 肝脏驻留Th1样细胞
重点核对
PBC患者肝脏和PBMC scRNA-seq数据 2OA-BSA免疫小鼠模型 巴瑞替尼治疗（10 mg/kg，每日一次，口服灌胃，持续2周） 流式细胞术分析CD69+CXCR6+CD4+ T细胞 免疫荧光检测CD69、CXCR6、IFNγ等
摘要
原发性胆汁性胆管炎（PBC）是一种慢性自身免疫性肝病，其特征是多谱系免疫失调，进而引起肝脏炎症、纤维化甚至肝硬化。由于传统检测方法的局限性，PBC的局部肝脏免疫发病机制尚未被完全阐明。在此，我们利用单细胞RNA测序技术描绘了PBC患者的免疫细胞图谱并解析其分子机制。我们发现胆管细胞和肝星状细胞参与肝脏炎症和纤维化。此外，枯否细胞表现出炎症因子水平升高和清道夫功能相关基因减少，而T细胞表现出炎症因子水平增强和细胞毒性相关基因减少。有趣的是，我们在PBC患者和PBC小鼠模型的肝脏中均鉴定出一个具有JAK-STAT激活的肝脏驻留Th1样细胞群。最后，阻断JAK-STAT通路可减轻小鼠PBC模型中的肝脏炎症并消除肝脏驻留Th1样细胞。总之，我们全面的单细胞转录组分析扩大了对PBC病理机制的理解，并为PBC患者的治疗提供了潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 原发性胆汁性胆管炎（PBC）患者肝脏局部免疫微环境的细胞异质性和分子机制是什么？
- 核心机制
- 肝脏驻留Th1样细胞通过激活JAK-STAT通路，分泌IFNγ等促炎因子，促进PBC的炎症和纤维化。
- 主要证据
- scRNA-seq鉴定出PBC患者和小鼠模型中扩增的肝脏驻留Th1样细胞，流式和免疫荧光验证其组织驻留和促炎特征，且JAK-STAT通路抑制（巴瑞替尼）可减轻小鼠胆管炎并减少这些细胞。
- 研究意义
- 为PBC提供了新的治疗靶点，特别是针对UCDA应答不佳的患者，JAK抑制剂可能成为潜在治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析非免疫细胞（胆管细胞和肝星状细胞）的病理特征
探究胆管细胞和肝星状细胞在PBC炎症和纤维化中的作用
重新聚类非免疫细胞，发现活化星状细胞和衰老胆管细胞；通过差异基因分析和KEGG通路富集，发现炎症和基质重塑基因上调；通过细胞间通讯分析及免疫荧光验证CCL21和GDF15的表达。
分析髓系细胞（单核细胞和枯否细胞）的功能变化
探索PBC中枯否细胞和单核细胞的炎症和吞噬功能改变
对髓系细胞亚群分析，发现枯否细胞炎症因子（IL1B、CXCL2）升高，清道夫受体（TLR4、MSR1等）降低；单核细胞数量减少与趋化因子受体CXCR4降低相关。
分析T细胞亚群，尤其是Th1样细胞的特征
揭示PBC中T细胞的促炎和细胞毒性功能变化
重新聚类T细胞，发现Th1样细胞比例增加，细胞毒性T细胞减少；Th1样细胞高表达炎症基因（IFNG等），且具有组织驻留特征（CD69、CXCR6等）。
构建2OA-BSA免疫小鼠模型并验证Th1样细胞
在小鼠模型中验证人类PBC中发现的肝脏驻留Th1样细胞的特征
2OA-BSA免疫C57BL/6J小鼠，对肝内细胞进行scRNA-seq，鉴定出与人类相似的Th1样细胞（Ifng+，Cd69+，Cxcr6+），并通过流式验证其比例增加。
抑制JAK-STAT通路评估对小鼠胆管炎的治疗效果
验证阻断JAK-STAT通路是否能缓解2OA-BSA诱导的小鼠胆管炎并减少Th1样细胞
给予巴瑞替尼治疗2周，检测肝脏pSTAT1水平、血清IgM-AMA、胆管损伤、肝内T细胞增殖及Th1样细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞测序 | 10x Genomics Chromium 单细胞3'试剂盒v3 | 10x Genomics | -- |
| NovaSeq平台 | Illumina | -- | |
| 免疫荧光 | Opal Polaris 7色手动免疫组化试剂盒 | PerkinElmer | NEL861001KT |
| 抗CD69抗体 | Abcam | ab233396 | |
| 抗CXCR6抗体 | Abcam | ab273116 | |
| 抗CD4抗体 | Invitrogen | 14-2444-82 | |
| 抗IFNγ抗体 | Abcam | ab231036 | |
| 抗TNFα抗体 | Abcam | ab270264 | |
| 抗CK19抗体 | Abcam | ab7754 | |
| 抗GDF15抗体 | Abcam | ab206414 | |
| 抗CCL21抗体 | Abcam | ab23116 | |
| 抗αSMA抗体 | Abcam | ab124964 | |
| 抗CLEC4C抗体 | Abcam | ab239078 | |
| 抗分泌素抗体 | Bioss | bs-0088R | |
| 免疫荧光（鼠） | 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 |
| 抗磷酸化Stat1 Ser727抗体 | CST | 8826 | |
| 抗CD3抗体 | Abcam | ab16669 | |
| 免疫组化（鼠） | 抗CD4抗体 | Abcam | ab183685 |
| 抗CD8抗体 | Abcam | ab217344 | |
| TUNEL染色 | 原位细胞死亡检测试剂盒，POD | Roche | 11684817910 |
| 细胞培养 | Liberase TM | Roche | -- |
| HEPES | Sigma | -- | |
| 动物实验 | 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | SRE0096 |
| N-羟基琥珀酰亚胺 | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 二环己基碳二亚胺 | Sigma-Aldrich | 379115 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| 乙酸乙酯/己烷 | Sigma-Aldrich | 270989/485624 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P2272 | |
| 完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 百日咳毒素 | List Biological Laboratories | -- | |
| 不完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 给药治疗 | 巴瑞替尼 | -- | -- |
| ELISA | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | 23227 |
| IFNγ ELISA试剂盒 | RayBiotech | ELM-IFNg-1 | |
| TNFα ELISA试剂盒 | RayBiotech | EKM-TNFa-1 | |
| 流式细胞术 | 白细胞活化鸡尾酒，含BD GolgiPlug | BD Biosciences | 550583 |
| Cytofix/Cytoperm试剂 | BD Biosciences | 562574 | |
| BV510仓鼠抗小鼠CD45抗体 | BD | 563891 | |
| BV786仓鼠抗小鼠CD3e抗体 | BD | 564379 | |
| BV786仓鼠抗小鼠TCRb抗体 | BD | 742484 | |
| BUV395大鼠抗小鼠CD4抗体 | BD | 563790 | |
| APC大鼠抗小鼠CD8a抗体 | BD | 553035 | |
| BV650大鼠抗小鼠CD44抗体 | BD | 740455 | |
| PE-Cy™7大鼠抗小鼠CD62L抗体 | BD | 560516 | |
| FITC仓鼠抗小鼠CD69抗体 | Biolegend | 104505 | |
| PE仓鼠抗小鼠CD103抗体 | Biolegend | 121406 | |
| FITC大鼠抗小鼠IFN-γ抗体 | BD | 554411 | |
| BV605小鼠抗小鼠Tbet抗体 | BD | 644817 | |
| 流式细胞术（人） | APC-H7小鼠抗人CD45抗体 | BD | 560178 |
| BUV395小鼠抗人CD3抗体 | BD | 564001 | |
| FITC小鼠抗人TCR αβ抗体 | BD | 555547 | |
| BV480小鼠抗人CD4抗体 | BD | 566104 | |
| BUV737小鼠抗人CD25抗体 | BD | 612806 | |
| Alexa Fluor® 647小鼠抗人FoxP3抗体 | BD | 560045 | |
| PE-Cy™7小鼠抗人CD69抗体 | BD | 557745 | |
| PE抗人CD186 (CXCR6)抗体 | Biolegend | 356003 | |
| Alexa Fluor® 700小鼠抗人CD8抗体 | BD | 557945 | |
| PE-CF594小鼠抗人穿孔素抗体 | BD | 563763 | |
| 流式细胞术 | CytoFLEX LX流式细胞仪 | Beckman | -- |
| 图像采集 | Olympus VS200和BX63显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA测序 | 样本来源、组织解离方法、10x Genomics试剂盒版本、测序平台（NovaSeq）、目标细胞回收数（6000细胞/通道） 阅读提示：Methods: scRNA-seq assay, Human liver tissue dissociation and PBMC isolation |
| 小鼠PBC模型 | 小鼠品系（C57BL/6JCrl）、年龄（8-10周）、性别（雄性，但方案部分描述为6周龄雌性，需核对）、免疫剂量（100 μg 2OA-BSA）、佐剂（CFA/IFA）、百日咳毒素剂量（100 ng）、免疫时间点 阅读提示：Methods: Animals, induction of cholangitis and Baricitinib treatment; 图6a示意图 |
| 巴瑞替尼治疗 | 剂量（10 mg/kg）、给药途径（口服灌胃）、给药频率（每日一次）、持续时间（2周）、溶剂（0.5%甲基纤维素） 阅读提示：Methods: Animals, induction of cholangitis and Baricitinib treatment |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号及荧光标记、细胞刺激条件（Leukocyte Activation Cocktail, 37°C 4h）、破膜试剂（Cytofix/Cytoperm）、检测仪器（CytoFLEX LX） 阅读提示：Methods: Flow cytometry |
| 免疫荧光染色 | 抗体及稀释度（原文未明确）、抗原修复方法、多重染色试剂盒（Opal Polaris 7-Color Manual IHC Kit） 阅读提示：Methods: Multiplex immunochemistry staining, immunohistochemistry and TUNEL staining |