EAE模型诱导及PKM2核转位观察
建立多发性硬化小鼠模型，并检测星形胶质细胞中PKM2的表达和核转位情况。
使用MOG35-55肽和CFA及PTX免疫C57BL/6小鼠诱导EAE，在发病、高峰和慢性期收集脊髓组织，通过免疫荧光染色观察PKM2与GFAP共定位，并定量核PKM2比例。
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泛素连接酶TRIM21表达上调促进实验性自身免疫性脑脊髓炎中PKM2核转位和星形胶质细胞活化
Upregulated expression of ubiquitin ligase TRIM21 promotes PKM2 nuclear translocation and astrocyte activation in experimental autoimmune encephalomyelitis.
实验完整度
高包括EAE动物模型、原代星形胶质细胞体外模型、单细胞RNA测序及体内敲低/药物干预等多个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
EAE小鼠模型（MOG35-55诱导的C57BL/6小鼠） 小鼠原代星形胶质细胞 MOG35-55刺激的脾细胞上清（MOGsup）激活的原代星形胶质细胞
重点核对
EAE小鼠模型使用MOG35-55肽和CFA及PTX诱导，C57BL/6雌性小鼠 DASA-58抑制PKM2核转位的体外浓度（50 μM）及预处理时间（30 min） TEPP-46腹腔注射剂量（50 mg/kg）及给药方案（从免疫后第0天至第8天隔天一次） shTRIM21慢病毒脑室内注射剂量（1×10^7 IU/只）及注射时间（免疫后第15天） MOGsup刺激原代星形胶质细胞的浓度（30%上清）和时间（12小时）
摘要
反应性星形胶质细胞在多发性硬化等多种神经系统疾病的发生中发挥关键作用。星形胶质细胞的活化通常伴随糖酵解为主的代谢转换。然而，代谢重编程在星形胶质细胞活化中的作用及分子机制尚未阐明。本研究发现，PKM2（糖酵解限速酶）在多发性硬化动物模型EAE（实验性自身免疫性脑脊髓炎）小鼠的星形胶质细胞中发生核转位。通过DASA-58抑制PKM2核输入可显著降低小鼠原代星形胶质细胞的活化，表现为增殖、糖酵解和炎性细胞因子分泌减少。最重要的是，我们鉴定了泛素连接酶TRIM21对PKM2核输入的泛素化介导调控。TRIM21与PKM2相互作用，促进其核转位并刺激其核活性，使其磷酸化STAT3、NF-κB并与c-myc相互作用。进一步的单细胞RNA测序和免疫荧光染色表明，EAE小鼠星形胶质细胞中TRIM21表达上调。在小鼠原代星形胶质细胞中过表达TRIM21可增强PKM2依赖性糖酵解和增殖，这种作用可被DASA-58逆转。此外，脑室内注射慢病毒载体敲低星形胶质细胞中的TRIM21，或腹腔注射抑制PKM2核转位的TEPP-46，均可有效降低EAE的疾病严重程度、中枢神经系统炎症和脱髓鞘。综上所述，我们的研究为核糖酵解酶PKM2的病理功能和参与星形胶质细胞活化的泛素化介导调控机制提供了新的见解。靶向该轴可能是治疗星形胶质细胞相关神经系统疾病的潜在治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中，星形胶质细胞活化是否伴随PKM2核转位以及其分子机制和功能作用是什么？
- 核心机制
- E3泛素连接酶TRIM21与PKM2相互作用，促进PKM2的K63连接泛素化及核转位，核PKM2磷酸化STAT3和NF-κB并与c-myc相互作用，增强糖酵解和星形胶质细胞增殖，促进星形胶质细胞活化和EAE发展。
- 主要证据
- 在EAE小鼠脊髓星形胶质细胞中观察到PKM2核转位；DASA-58抑制PKM2核转位后，星形胶质细胞的增殖、糖酵解和炎症因子分泌减少；免疫共沉淀验证TRIM21与PKM2结合并促进其核转位；单细胞RNA测序显示EAE星形胶质细胞中TRIM21表达上调；体内敲低TRIM21或使用TEPP-46抑制PKM2核转位均减轻EAE的疾病严重程度、炎症和脱髓鞘。
- 研究意义
- 本研究揭示了核糖酵解酶PKM2的病理功能和泛素化介导的调控机制，为星形胶质细胞相关神经系统疾病（如多发性硬化）的治疗提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外星形胶质细胞活化模型建立
验证体外激活的星形胶质细胞中PKM2的核转位是否重现体内现象。
分离新生小鼠原代星形胶质细胞，用MOG35-55刺激的EAE小鼠脾细胞上清（MOGsup）处理不同时间，通过免疫荧光检测PKM2和GFAP表达。
抑制PKM2核转位的功能验证
探究PKM2核转位对星形胶质细胞糖酵解、增殖和炎症因子表达的影响。
用DASA-58预处理原代星形胶质细胞，再以MOGsup刺激，检测PKM2核转位、糖酵解水平（葡萄糖消耗和乳酸产生）、细胞增殖（CCK-8和EdU）、炎症因子mRNA表达及信号通路蛋白磷酸化。
鉴定PKM2相互作用蛋白
寻找调控PKM2核转位的上游分子，特别是泛素化相关蛋白。
对未刺激和MOGsup刺激的原代星形胶质细胞进行PKM2免疫沉淀，结合质谱鉴定相互作用蛋白，并通过生物信息学分析（GO、KEGG）筛选候选分子，重点关注TRIM21。
TRIM21与PKM2直接结合验证
确认TRIM21与PKM2之间的物理相互作用及结合结构域。
通过内源性免疫共沉淀、外源性共转染和截短突变体免疫共沉淀，验证TRIM21与PKM2的结合及关键结构域。
TRIM21促进PKM2泛素化和核转位
验证TRIM21是否通过泛素化修饰促进PKM2核转位。
在原代星形胶质细胞中过表达或敲低TRIM21，检测PKM2的核转位和K63连接泛素化水平。
TRIM21对PKM2核功能及细胞功能的影响
评估TRIM21促进PKM2核转位后，对PKM2核内伴侣结合、信号通路激活、糖酵解和增殖的影响。
在TRIM21过表达的星形胶质细胞中，检测PKM2与STAT3、NF-κB、c-myc的结合，STAT3和NF-κB磷酸化，以及DASA-58处理对糖酵解和增殖的逆转作用。
体内敲低TRIM21或抑制PKM2核转位的治疗效果
在EAE小鼠模型中验证靶向TRIM21-PKM2轴的治疗潜力。
通过脑室内注射shTRIM21慢病毒（GFAP启动子）或腹腔注射TEPP-46，评估EAE疾病严重程度、脊髓炎症、脱髓鞘及星形胶质细胞和小胶质细胞活化情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| EAE诱导 | MOG35-55肽 | -- | -- |
| 完全弗氏佐剂（CFA） | -- | -- | |
| 不完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 百日咳毒素 | List Biological Laboratories | -- | |
| 动物处理 | TEPP-46 | -- | -- |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清（FBS） | -- | -- | |
| 细胞分离 | 神经组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotech | -- |
| 抗GLAST磁珠试剂盒 | Miltenyi Biotech | -- | |
| 单细胞测序 | 成年脑解离试剂盒 | Miltenyi | -- |
| Chromium单细胞3'文库 | 10x Genomics | -- | |
| Illumina NovaSeq6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 免疫沉淀 | Dynabeads M-270环氧磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 质谱 | Q-Exactive Orbitrap质谱仪 | Thermo Fisher | -- |
| 糖酵解检测 | 葡萄糖氧化酶法 | Applygen Technologies | -- |
| 乳酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 免疫荧光 | 抗PKM2抗体 | Bioss | bs-0101R |
| 抗GFAP抗体 | Huabio | EM140707 | |
| 抗TRIM21抗体 | Proteintech | 12108-1-AP | |
| 抗MBP抗体 | Proteintech | 10458-1-AP | |
| 抗IBA1抗体 | Wako | 019-19741 | |
| Alexa Fluor 488或Cy3偶联二抗 | Zhuangzhibio | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 细胞增殖 | EdU-488或EdU-594细胞增殖检测试剂盒 | Beyotime | C0071S、C0078S |
| CCK-8 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Topscience | -- | |
| 核质提取试剂盒 | Solarbio | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL检测系统 | Tanon 4600 | -- | |
| 抗PKM2抗体 | Proteintech | 60268-1-Ig | |
| 抗磷酸化c-myc抗体 | Huabio | ET1609-64 | |
| 抗c-myc抗体 | Cohesion Biosciences | CPA1778 | |
| 抗LDHA抗体 | Huabio | ET1608-57 | |
| 抗STAT3抗体 | Proteintech | 60199-1-Ig | |
| 抗磷酸化STAT3抗体 | Bioss | bs-1658R | |
| 抗磷酸化p65抗体 | Servicebio | GB113882-100 | |
| 抗p65抗体 | Cohesion Biosciences | CPA2000 | |
| 抗磷酸化IKK抗体 | Bioss | bs-3237R | |
| 抗IKK抗体 | ServiceBio | GB11292-1-100 | |
| 抗Lamin抗体 | Cohesion Biosciences | CPA1693 | |
| 抗Tubulin抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| 抗Flag抗体 | Abclonal | AE004 | |
| 抗Myc抗体 | Abclonal | AE010 | |
| 抗TRIM21抗体 | Proteintech | 12108-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | ServiceBio | GB12001-100 | |
| qPCR | TRIzol | -- | -- |
| 逆转录试剂盒 | DEEYEE | -- | |
| 2×qPCR SmArt Mix | DEEYEE | -- | |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher | -- | |
| 组织染色 | LFB染色液 | Servicebio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EAE诱导 | 小鼠品系、性别、年龄；MOG35-55剂量；CFA成分及体积；PTX剂量及注射时间 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments |
| 原代星形胶质细胞分离与培养 | 新生小鼠组织来源；解离试剂盒和磁珠分选方法；培养条件（DMEM+10% FBS） 阅读提示：Materials and methods: Isolation and culture of primary astrocytes |
| MOGsup刺激 | 脾细胞来源（EAE小鼠发病时间）；MOG35-55刺激浓度；刺激时间；上清收集方法及使用比例 阅读提示：Materials and methods: Splenocyte isolation and supernatant of MOG35-55-stimulated-splenocytes |
| DASA-58处理 | DASA-58浓度（50 μM）和预处理时间（30 min）；刺激时间（12 h） 阅读提示：Figure 2 legend |
| TRIM21过表达/敲低 | 慢病毒载体（GFAP启动子）；感染复数（MOI）或滴度；敲低序列；处理时间 阅读提示：Materials and methods: Lentivirus-mediated short hairpin RNA interference and overexpression |
| TEPP-46治疗 | 剂量（50 mg/kg）；给药方式（腹腔注射）；给药时间点（第0-8天隔天一次） 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments; Figure 7—figure supplement 2 |
| 体内敲低TRIM21 | 病毒滴度（1×10^7 IU/只）；注射方式（脑室内）；注射坐标；注射时间（免疫后第15天） 阅读提示：Materials and methods: In vivo injection of lentivirus; Figure 7 legend |
| 单细胞RNA测序 | 组织来源（脑）；解离方法（10x Genomics）；测序平台；分析流程（Cell Ranger版本） 阅读提示：Materials and methods: Single-cell RNA sequencing |