Recombinant humanized type III collagen inhibits ovarian cancer and induces protective anti-tumor immunity by regulating autophagy through GSTP1.
研究包含体外细胞功能实验（增殖、迁移、侵袭、凋亡）、自噬检测（Western blot、TEM、LC3荧光）、RNA-seq与蛋白质组学联合分析、GSTP1敲低/过表达拯救实验、体内裸鼠及BALB/C小鼠肿瘤模型，并进行了免疫细胞分析及组织学验证。
人卵巢癌细胞系A2780 人卵巢癌细胞系SKOV3 小鼠卵巢癌ID8细胞皮下移植模型（BALB/C小鼠） 人卵巢癌皮下移植瘤模型（裸鼠）
细胞系：A2780、SKOV3、ID8，来源及STR鉴定（A2780和SKOV3） rhCOLIII浓度：体外0.5-8 mg/ml，体内8 mg/ml（每只0.8 mg） GSTP1敲低（siRNA）与过表达（慢病毒）处理 自噬调节剂：rapamycin（激活）和chloroquine（抑制） 体内模型：裸鼠皮下注射A2780细胞（5×10^6），BALB/C小鼠皮下注射ID8细胞（5×10^6），处理周期（12天或18天）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
制备并表征rhCOLIII材料，验证其结构特性和生物安全性，为后续实验奠定基础。
将人III型胶原α1链Gly483-Pro512片段进行16次串联重复，构建重组表达载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经诱导表达和纯化获得rhCOLIII。通过Edman降解法、LC-MS/MS、SEM、Fourier分析等方法表征其序列、分子量和微观结构。体内生物安全性实验包括对BALB/C小鼠和裸鼠进行注射处理，观察体重、主要脏器H&E染色、肝肾功能。
检测rhCOLIII对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。
使用A2780和SKOV3细胞系，通过EdU、CCK-8、集落形成、划痕实验、Transwell实验和流式细胞术检测不同浓度rhCOLIII处理后的细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡变化。
检测rhCOLIII对卵巢癌细胞自噬的影响，并探讨其在抗肿瘤功能中的作用。
通过Western blot检测自噬相关蛋白（ATG3、ATG5、LC3、NBR1、P62）表达；使用Ad-mCherry-GFP-LC3转染观察自噬流；TEM观察自噬体；利用ATG5敲除（CRISPR-Cas9）和rapamycin处理调控自噬，检测细胞增殖变化。
探究rhCOLIII对MHC-1表达的影响及其与自噬的关系。
通过Western blot和免疫荧光检测不同处理（rhCOLIII、rapamycin、chloroquine）下MHC-1的表达；通过siRNA敲低ATG3、ATG5、NBR1、P62观察MHC-1变化；Co-IP和免疫荧光验证NBR1与MHC-1的相互作用。
通过双组学联合分析筛选rhCOLIII作用的潜在靶点。
对rhCOLIII处理与对照A2780细胞进行RNA-seq和蛋白质组学分析，通过KEGG富集分析、差异表达分析等，筛选出与自噬和免疫相关的候选基因GSTP1。
验证GSTP1在rhCOLIII抑制自噬、增殖、迁移和侵袭中的作用。
通过siRNA敲低和慢病毒过表达GSTP1，观察细胞增殖、迁移、侵袭和自噬水平的变化，并在rhCOLIII处理下评估其效应。
评估rhCOLIII在体内的抗肿瘤效果及其对免疫微环境的调节作用。
建立裸鼠A2780皮下移植瘤模型和BALB/C小鼠ID8皮下移植瘤模型，给予rhCOLIII或PBS处理，测量肿瘤体积和重量，通过TUNEL、IHC、免疫荧光、流式细胞术检测肿瘤组织中凋亡、自噬相关蛋白、胶原形态和免疫细胞浸润。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| McCoy's 5A培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | PAN | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Beyotime | C0222 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 嘌呤霉素 | Beyotime | -- | |
| 细胞增殖实验 | BeyoClick™ EdU细胞增殖检测试剂盒（Alexa Fluor 594） | Beyotime | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 流式分析 | 碘化丙啶溶液 | Beyotime | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| MHC-I一抗 | Bioss | bs-7335R | |
| LC3抗体 | CST | D3U4C | |
| NBR1抗体 | CST | E6Q3F | |
| ATG3抗体 | Proteincht | 10181-2-AP | |
| ATG5抗体 | Proteincht | 111262-2-AP | |
| P62抗体 | Proteincht | 18420-1-AP | |
| GSTP1抗体 | Proteincht | 15902-1-AP | |
| 羊抗兔/鼠IgG二抗 | Bioss | bs-40295G-HRP | |
| 增强化学发光试剂盒 | Millipore | -- | |
| 免疫共沉淀 | 通用免疫沉淀/共免疫沉淀试剂盒 | Abbkine | -- |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | Abbkine | -- | |
| 自噬流检测 | 腺病毒mCherry-GFP-LC3 | Genepharma | -- |
| 生物素标记 | 生物素快速标记试剂盒 | Frdbbio | -- |
| 二甲基亚砜 | Solarbio | -- | |
| 组织染色 | Masson染色试剂盒 | Sewell | -- |
| 天狼星红染色 | MEIMIAN | -- | |
| TUNEL检测试剂盒（HRP-DAB） | Roche | -- | |
| 组织芯片 | 人卵巢组织芯片（ZLOVA961） | Shanghai Zhuolibiotech Company | -- |
| 免疫荧光 | CD3抗体 | Abcam | -- |
| CD4抗体 | Abcam | -- | |
| CD8抗体 | Abcam | -- | |
| MHC-1抗体 | Proteincht | -- | |
| LC3抗体 | Santa | -- | |
| 流式分析 | PE标记抗CD3抗体 | BioLegend | -- |
| FITC标记抗CD4抗体 | BioLegend | -- | |
| PE标记抗CD8抗体 | BioLegend | -- | |
| 蛋白测序 | PPSQ自动化蛋白多肽测序仪 | SHIMADZU | -- |
| 质谱分析 | 高分辨率质谱仪 | Waters | -- |
| 超高效液相色谱 | Waters | -- | |
| 仪器设备 | 流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 显微镜 | 共聚焦激光扫描显微镜 | Nikon | -- |
| 倒置显微镜 | Nikon | -- | |
| 电镜 | 透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 多光子成像 | 奥林巴斯激光扫描FV1200 MPE多光子显微镜 | Olympus | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：A2780（DMEM）、SKOV3（McCoy's 5A）、ID8（未指明）；培养基添加物（10% FBS、1%青霉素-链霉素），培养条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：Materials and methods 2.2 Cell culture |
| rhCOLIII处理浓度 | rhCOLIII浓度：体外0, 0.5, 1, 2, 4, 8 mg/ml；体内8 mg/ml（每只0.8 mg） 阅读提示：Materials and methods 2.2 Cell culture, 2.15 Animal models |
| 细胞增殖检测 | 细胞接种密度（96孔板3.0×10^3/孔），处理时间（48小时），检测试剂盒（BeyoClick EdU） 阅读提示：Materials and methods 2.5 Cell proliferation assay |
| 迁移侵袭检测 | Transwell上室细胞数（5×10^4），划痕实验细胞密度（1×10^6/孔），使用rhCOLIII浓度（8 mg/ml），处理时间（24小时或48小时） 阅读提示：Materials and methods 2.6 Transwell assay, 2.7 Scratch test |
| 自噬检测 | 自噬相关蛋白抗体（anti-LC3, anti-P62, anti-ATG3, anti-ATG5, anti-NBR1），rhCOLIII浓度（0, 2, 4, 8 mg/ml），处理时间（48小时） 阅读提示：Materials and methods 2.10 Western blot assay, 2.12 Ad-mCherry-GFP-LC3 transfection |
| GSTP1敲低/过表达 | siRNA序列（补充表S1），过表达慢病毒载体，筛选方法（嘌呤霉素2.5 μg/mL处理1-2周） 阅读提示：Materials and methods 2.3 Cell transfection |
| 体内动物实验 | 动物品系（裸鼠、BALB/C小鼠），周龄（4-6周），细胞注射数量（5×10^6），处理方案（100 μL 8 mg/ml rhCOLIII，每3天一次），处理时间（裸鼠12天，BALB/C小鼠18天） 阅读提示：Materials and methods 2.15 Animal models: Establishment and treatments |
