JPHYP成分分析
鉴定JPHYP的主要化学成分
采用UPLC-Q-TOF/MS对JPHYP样品进行分析，结合高分辨质谱数据库和相关文献，鉴定出67种化合物。
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健脾化瘀方通过改善炎症和重塑ApoE-/-小鼠肠道菌群预防动脉粥样硬化
Jianpi Huayu Prescription Prevents Atherosclerosis by Improving Inflammation and Reshaping the Intestinal Microbiota in ApoE-/- Mice.
实验完整度
高包含体外细胞模型、ApoE-/-小鼠动物模型、16S rRNA肠道菌群测序、多组学分析及分子机制验证，证据层级丰富。
主要模型
LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型 高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型
重点核对
JPHYP剂量：体内高、中、低剂量分别为56、28、14 g·kg-1，体外含药血清稀释60% LPS处理：RAW264.7细胞用1 μg/mL LPS刺激24小时 TAK-242作为TLR4特异性阻断剂，浓度为10 nmol/L 动物分组：ApoE-/-小鼠随机分为模型、阳性对照（阿托伐他汀3 mg·kg-1）、JPHYP高、中、低剂量组，每组12只 主要检测指标：血脂、炎症因子、主动脉斑块、肠道菌群、TLR4/MyD88/MAPK通路蛋白
摘要
本研究建立LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症损伤模型和AS小鼠易损斑块模型，观察健脾化瘀方（JPHYP）对巨噬细胞炎症、斑块形成、血脂、炎症水平、肠道菌群及TLR4/MyD88/MAPK通路的影响，探讨JPHYP的抗AS作用及分子机制，并检测小鼠肠道微生物16S rRNA。比较不同组小鼠肠道菌群差异，进一步探讨JPHYP的干预效果，阐明JPHYP通过调节TLR4/MyD88/MAPK炎症信号通路和改善肠道菌群防治AS的分子生物学机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- JPHYP是否通过调节TLR4/MyD88/MAPK信号通路和改善肠道菌群来预防动脉粥样硬化？
- 核心机制
- JPHYP通过抑制TLR4/MyD88/MAPK信号通路，减少炎症因子释放，并改善肠道菌群多样性，修复肠道屏障，降低LPS水平，从而减轻动脉粥样硬化。
- 主要证据
- 体外实验显示JPHYP降低LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞ROS和炎症因子水平，抑制TLR4/MyD88/MAPK通路蛋白表达；体内实验显示JPHYP降低ApoE-/-小鼠血脂和炎症因子水平，减少主动脉斑块面积，改善肠道组织形态，上调紧密连接蛋白，调节肠道菌群组成。
- 研究意义
- 本研究首次证明JPHYP治疗可特异性改变Turicibacter、Muribaculaceae和Bacteroidetes的丰度，为通过调控肠道菌群治疗AS的药物开发提供科学依据，并为中药防治AS提供了理论基础和实验证据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞模型建立与药物处理
建立LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型，并确定JPHYP最佳处理浓度
RAW264.7细胞用LPS(1 μg/mL)刺激24小时建立炎症模型；采用CCK-8法检测不同浓度JPHYP含药血清对细胞活性的影响，确定最佳稀释浓度为60%；随后用含药血清处理细胞24小时，部分实验加入TLR4阻断剂TAK-242(10 nmol/L)。
体外炎症与氧化应激检测
评估JPHYP对巨噬细胞炎症和氧化应激的影响
采用CLSM检测细胞内ROS水平；采用ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的表达水平。
动物模型建立与分组给药
建立高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型，并给予JPHYP干预
8周龄雄性ApoE-/-小鼠(60只)高脂饮食喂养12周建立AS模型，随机分为5组：模型组、阳性对照组(阿托伐他汀3 mg·kg-1)、JPHYP高剂量组(56 g·kg-1)、中剂量组(28 g·kg-1)、低剂量组(14 g·kg-1)，灌胃给药；另设C57BL/6J对照组(12只)常规饮食。
体内血脂与炎症因子检测
评估JPHYP对AS小鼠血脂和炎症水平的影响
使用全自动生化仪检测血清TC、TG、LDL-C和HDL-C；ELISA检测血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1。
主动脉斑块分析
评估JPHYP对AS小鼠主动脉斑块形成的影响
主动脉油红O染色观察大体斑块；主动脉根部切片进行HE、Masson和油红O染色，使用Image Pro Plus 6.0分析斑块面积。
肠道组织形态与屏障功能检测
评估JPHYP对AS小鼠肠道组织形态、黏蛋白和紧密连接蛋白的影响
结肠组织HE染色观察形态；阿尔辛蓝染色和WGA荧光染色检测黏蛋白；Western blot检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin1、Claudin1和JAM-1的表达。
信号通路蛋白检测
验证JPHYP对TLR4/MyD88/MAPK信号通路的调控作用
采用免疫组化和Western blot检测主动脉和巨噬细胞中TLR4、MyD88、JNK、p-JNK、AP-1、P38MAPK、p-P38MAPK的表达水平。
肠道菌群分析
评估JPHYP对AS小鼠肠道菌群组成和多样性的影响
提取粪便DNA，对16S rRNA V3-V4区进行扩增和测序，分析菌群多样性、丰度及差异菌群。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞功能检测
炎症因子检测
动物模型与病理分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物制备 | 健脾化瘀方 | The First Affiliated Hospital of Shihezi University | 20180870 |
| 药物处理 | 阿托伐他汀 | Pfizer | EL2614 |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Punosai | WHB823D211 |
| 胎牛血清 | UE | F90701 | |
| 青霉素/链霉素 | Solarbio | P1400 | |
| 细胞处理 | 脂多糖 | Solarbio | IL2020 |
| 信号通路抑制 | TAK-242 | Wuhan Proteintech | CM00939 |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | -- | E-EL-M3063 |
| IL-1β ELISA试剂盒 | -- | E-EL-M0037c | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | -- | E-EL-M0044c | |
| MCP-1 ELISA试剂盒 | -- | E-EL-M3001 | |
| LPS ELISA试剂盒 | -- | MM-0634M1 | |
| 组织固定 | 4%聚合固定液 | Biosharp | 70100900 |
| 生化分析 | 全自动生化分析仪Chemray 240 | Rayto | -- |
| 质谱分析 | 超高效液相色谱仪H-Class | Waters | -- |
| 高分辨质谱仪Triple TOF 4600 | AB Sciex | -- | |
| Western blot | GAPDH抗体 | CST | -- |
| β-actin抗体 | Servicebio | AC220110015 | |
| TLR4抗体 | Wuhan Proteintech | 66350-1-lg | |
| MyD88抗体 | Wuhan Proteintech | 67969-1-lg | |
| JNK抗体 | Wuhan Proteintech | 66210-1-lg | |
| p-JNK抗体 | Bioss | bsm-52462R | |
| AP-1抗体 | Wuhan Proteintech | 66590-1-lg | |
| P38MAPK抗体 | Wuhan Proteintech | -- | |
| p-P38MAPK抗体 | Bioss | bs-5476R | |
| ZO-1抗体 | Abcam | ab276131 | |
| Occludin1抗体 | Wuhan Proteintech | 66378-1-Ig | |
| Claudin1抗体 | Abcam | ab307692 | |
| JAM-1抗体 | Abcam | ab270446 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | Beijing Zhongshan Golden Bridge | 224800105 | |
| 山羊抗兔二抗 | Wuhan Servicebio | CR2110082 | |
| 超敏ECL化学发光试剂盒 | Wuhan Servicebio | CR2112141 | |
| 16S rRNA测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| NovaSeq 6000 SP试剂盒 | Illumina | -- | |
| 图像分析 | Image Pro Plus 6.0 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型建立与处理 | RAW264.7细胞用1 μg/mL LPS刺激24小时；JPHYP含药血清稀释60%处理24小时；TAK-242浓度10 nmol/L 阅读提示：Methods-细胞模型建立、细胞培养与处理 |
| 动物模型与分组给药 | ApoE-/-小鼠高脂饮食12周；分组：模型组、阳性对照组（阿托伐他汀3 mg·kg-1）、JPHYP-H（56 g·kg-1）、JPHYP-M（28 g·kg-1）、JPHYP-L（14 g·kg-1） 阅读提示：Methods-动物、HFD诱导AS模型 |
| 血脂检测 | 使用全自动生化仪检测TC、TG、LDL-C、HDL-C 阅读提示：Methods-血脂检查 |
| 炎症因子检测 | 血清和细胞上清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的测定 阅读提示：Methods-酶联免疫吸附试验 |
| 主动脉斑块定量 | 主动脉油红O染色及主动脉根部HE、Masson、油红O染色；Image Pro Plus 6.0分析斑块面积 阅读提示：Methods-动脉粥样硬化病变分析 |
| 肠道屏障功能检测 | 结肠组织HE、阿尔辛蓝、WGA染色；Western blot检测ZO-1、Occludin1、Claudin1、JAM-1 阅读提示：Methods-大肠组织形态观察、Western blot |
| 信号通路蛋白检测 | 免疫组化和Western blot检测TLR4、MyD88、JNK、p-JNK、AP-1、P38MAPK、p-P38MAPK 阅读提示：Methods-免疫组化分析、Western blot |
| 肠道菌群测序 | 16S rRNA V3-V4区测序；样本为盲肠内容物；测序平台NovaSeq 6000 阅读提示：Methods-粪便样本采集与16S rRNA基因测序 |