细胞毒性评估
确定FB1对TM4细胞活力的影响及最佳毒性浓度。
使用CCK-8法检测不同浓度FB1(0, 5, 10, 20, 40, 80 μM)处理48小时后的细胞活力,并通过TUNEL染色检测凋亡,评估凋亡和增殖相关基因表达。
The Protective Effect of Quercetin against the Cytotoxicity Induced by Fumonisin B1 in Sertoli Cells.
体外细胞实验,涵盖细胞活力、凋亡、氧化应激、代谢及转录组分析,但缺少体内验证。
TM4小鼠支持细胞系
FB1处理浓度:80 μM 槲皮素处理浓度:40 μM 处理时间:48小时 细胞系:TM4小鼠支持细胞系 分组:Control、FB1、FB1+QR
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定FB1对TM4细胞活力的影响及最佳毒性浓度。
使用CCK-8法检测不同浓度FB1(0, 5, 10, 20, 40, 80 μM)处理48小时后的细胞活力,并通过TUNEL染色检测凋亡,评估凋亡和增殖相关基因表达。
验证槲皮素对FB1诱导毒性的保护作用及最佳浓度。
使用CCK-8法检测不同浓度槲皮素(0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μM)处理后的细胞活力,并评估联合处理(40 μM槲皮素+80 μM FB1)对细胞活力、凋亡及功能基因表达的影响。
探究槲皮素对FB1诱导的氧化应激和线粒体损伤的改善作用。
检测ROS、MDA水平,抗氧化基因表达及SOD活性,并使用JC-1探针检测线粒体膜电位。
揭示槲皮素保护作用涉及的差异表达基因和信号通路。
对Control、FB1和FB1+QR组进行RNA-seq,鉴定差异表达基因,并进行KEGG富集分析。
验证FB1对糖酵解的影响及槲皮素的恢复作用。
测量ATP、葡萄糖、丙酮酸和乳酸含量,检测糖酵解相关基因表达和PKM、LDHA活性。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | TM4细胞 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0456 |
| DMEM/F12培养基 | Procell | PM150312 | |
| 马血清 | Procell | 164215 | |
| 胎牛血清 | Procell | 164210 | |
| 青霉素-链霉素 | Procell | PB180120 | |
| CO2培养箱 | Thermo Scientific | 3111 | |
| 药物处理 | 伏马菌素B1 | Aladdin | F135527 |
| 槲皮素 | Aladdin | Q111274 | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | MCE | HY-K0301 |
| 分光光度计 | Thermo Scientific | 1530-00183 | |
| 凋亡检测 | TUNEL检测试剂盒 | Jiangsu KeyGEN BioTECH Corp., Ltd. | KGA1406 |
| 荧光显微镜 | Zeiss | -- | |
| 氧化应激检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | s0033s |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1011 | |
| 酶标仪 | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| 超声波细胞破碎仪 | SCIENTZ | JY92-IIN | |
| 丙二醛检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003 | |
| 超氧化物歧化酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| 紫外可见分光光度计 | Shimadzu | BioSpec-nano | |
| cDNA合成 | PrimeScript™ RT试剂盒 | TaKaRa | RR037A |
| Western blot | cOmplete™蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693116001 |
| SOD1抗体 | Proteintech | 10269-1-AP | |
| PRDX1抗体 | Proteintech | 15816-1-AP | |
| PKM2抗体 | Bioss | bs-0101R | |
| LDHA抗体 | Proteintech | 19987-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Servicebio | GB15002 | |
| 线粒体膜电位检测 | 线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) | Beyotime | C2006 |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A095 |
| 代谢物检测 | 葡萄糖检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A154-1-1 |
| 乳酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A019-2-1 | |
| 酶活性检测 | PKM活性检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A076-1-1 |
| LDH活性检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A020-2 | |
| 线粒体染色 | MitoTracker® Red CMXRos | Cell Signaling Technology | #9082 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | TM4细胞来源、培养基成分、FB1和槲皮素浓度、DMSO对照、处理时间48小时 阅读提示:Materials and Methods 4.1 Cell Culture and Treatment |
| 细胞活力与凋亡检测 | CCK-8检测的细胞密度、TUNEL实验的固定和透化条件 阅读提示:Materials and Methods 4.2 CCK-8 Assay 和 4.3 TUNEL Assay;Figure 1 和 2 的图注 |
| 氧化应激与线粒体功能检测 | ROS检测的DCFH-DA浓度和孵育时间、MDA和SOD检测的细胞处理、JC-1染色的孵育时间 阅读提示:Materials and Methods 4.4 Measurement of ROS, MDA and SOD Activity 和 4.7 MMP Detection |
| 能量代谢检测 | ATP、葡萄糖、丙酮酸、乳酸检测的样品制备方法,PKM和LDHA活性检测的样品制备 阅读提示:Materials and Methods 4.8 Measurement of ATP, 4.9 Determination of Glucose, Pyruvate, and Lactic Acid Levels, 4.10 Measurement of PKM and LDHA Activity |
| 转录组分析 | RNA-seq的生物学重复数、差异表达阈值、KEGG富集分析方法 阅读提示:Materials and Methods 4.12 RNA-Seq and Transcriptome Data Analysis |