槲皮素对伏马菌素B1诱导的支持细胞毒性的保护作用

The Protective Effect of Quercetin against the Cytotoxicity Induced by Fumonisin B1 in Sertoli Cells.

作者信息Jun Ma, Ruixue Huang, Huai Zhang, Dongju Liu, Xiaodong Dong, Yan Xiong, Xianrong Xiong, Daoliang Lan, Wei Fu, Honghong He, Jian Li, Shi Yin
PMID39201451
发布时间2024-08-12
DOI10.3390/ijms25168764

实验完整度

体外细胞实验,涵盖细胞活力、凋亡、氧化应激、代谢及转录组分析,但缺少体内验证。

主要模型

TM4小鼠支持细胞系

重点核对

FB1处理浓度:80 μM 槲皮素处理浓度:40 μM 处理时间:48小时 细胞系:TM4小鼠支持细胞系 分组:Control、FB1、FB1+QR

摘要

伏马菌素B1(FB1)是由镰刀菌属产生的真菌毒素,普遍存在于农作物和动物饲料中,对牲畜和人类健康构成重大风险。FB1在支持细胞中诱导氧化应激,破坏睾丸结构,并影响精子发生。然而,减轻FB1对睾丸生殖毒性的方法仍不清楚。槲皮素是一种天然黄酮类抗氧化剂,可能提供保护作用。本研究探讨了槲皮素对FB1诱导的TM4细胞(一种支持细胞系)生殖毒性的保护作用和机制。结果表明,40 μM槲皮素提高了细胞活力,减少了细胞凋亡,并保持了细胞功能。槲皮素还降低了暴露于FB1的TM4细胞中活性氧(ROS)水平,增强了抗氧化基因的表达,并改善了线粒体膜电位。与单独使用FB1相比,槲皮素和FB1联合使用增加了ATP水平,以及糖酵解关键产物丙酮酸和乳酸。此外,这种组合提高了糖酵解相关基因的mRNA和蛋白表达,包括葡萄糖-6-磷酸异构酶1(Gpi1)、己糖激酶2(Hk2)、醛缩酶(Aldoa)、丙酮酸激酶(Pkm)、乳酸脱氢酶A(Ldha)和磷酸果糖激酶,肝,B型(Pfkl)。槲皮素还增强了PKM和LDHA的活性,这两种关键的糖酵解酶。总之,槲皮素通过降低ROS水平和增强糖酵解来减轻FB1诱导的TM4细胞毒性。这项研究为预防和治疗FB1诱导的雄性生殖系统毒性损伤提供了新的见解,并突出了槲皮素的潜在应用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
槲皮素能否减轻FB1诱导的支持细胞毒性及其潜在分子机制。
核心机制
槲皮素通过降低ROS水平、增强抗氧化能力和恢复线粒体膜电位,并上调糖酵解相关基因表达和酶活性,从而恢复能量代谢,减轻FB1诱导的细胞毒性。
主要证据
在TM4细胞中,槲皮素处理提高了细胞活力、降低了凋亡、减少了ROS和MDA,增加了抗氧化基因表达和SOD活性,恢复了线粒体膜电位,并提高了ATP、丙酮酸和乳酸水平,上调了糖酵解基因表达及PKM和LDHA活性。
研究意义
为预防和治疗FB1诱导的雄性生殖系统毒性提供了新见解,并强调了槲皮素的潜在应用价值。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

细胞毒性评估

确定FB1对TM4细胞活力的影响及最佳毒性浓度。

使用CCK-8法检测不同浓度FB1(0, 5, 10, 20, 40, 80 μM)处理48小时后的细胞活力,并通过TUNEL染色检测凋亡,评估凋亡和增殖相关基因表达。

2

槲皮素保护作用评估

验证槲皮素对FB1诱导毒性的保护作用及最佳浓度。

使用CCK-8法检测不同浓度槲皮素(0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μM)处理后的细胞活力,并评估联合处理(40 μM槲皮素+80 μM FB1)对细胞活力、凋亡及功能基因表达的影响。

3

氧化应激和线粒体功能检测

探究槲皮素对FB1诱导的氧化应激和线粒体损伤的改善作用。

检测ROS、MDA水平,抗氧化基因表达及SOD活性,并使用JC-1探针检测线粒体膜电位。

4

转录组分析

揭示槲皮素保护作用涉及的差异表达基因和信号通路。

对Control、FB1和FB1+QR组进行RNA-seq,鉴定差异表达基因,并进行KEGG富集分析。

5

能量代谢检测

验证FB1对糖酵解的影响及槲皮素的恢复作用。

测量ATP、葡萄糖、丙酮酸和乳酸含量,检测糖酵解相关基因表达和PKM、LDHA活性。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
TM4细胞Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0456
DMEM/F12培养基ProcellPM150312
马血清Procell164215
胎牛血清Procell164210
青霉素-链霉素ProcellPB180120
CO2培养箱Thermo Scientific3111
伏马菌素B1AladdinF135527
槲皮素AladdinQ111274
细胞计数试剂盒-8MCEHY-K0301
分光光度计Thermo Scientific1530-00183
TUNEL检测试剂盒Jiangsu KeyGEN BioTECH Corp., Ltd.KGA1406
荧光显微镜Zeiss--
活性氧检测试剂盒Beyotimes0033s
Hoechst 33258BeyotimeC1011
酶标仪Molecular DevicesSpectraMax iD5
超声波细胞破碎仪SCIENTZJY92-IIN
丙二醛检测试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA003
超氧化物歧化酶检测试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-2
TRIzol试剂Invitrogen15596026
紫外可见分光光度计ShimadzuBioSpec-nano
PrimeScript™ RT试剂盒TaKaRaRR037A
cOmplete™蛋白酶抑制剂混合物Roche04693116001
SOD1抗体Proteintech10269-1-AP
PRDX1抗体Proteintech15816-1-AP
PKM2抗体Biossbs-0101R
LDHA抗体Proteintech19987-1-AP
GAPDH抗体ServicebioGB15002
线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)BeyotimeC2006
ATP检测试剂盒Nanjing JianchengA095
葡萄糖检测试剂盒Nanjing JianchengA154-1-1
乳酸检测试剂盒Nanjing JianchengA019-2-1
PKM活性检测试剂盒Nanjing JianchengA076-1-1
LDH活性检测试剂盒Nanjing JianchengA020-2
MitoTracker® Red CMXRosCell Signaling Technology#9082

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养与处理
TM4细胞来源、培养基成分、FB1和槲皮素浓度、DMSO对照、处理时间48小时
阅读提示:Materials and Methods 4.1 Cell Culture and Treatment
细胞活力与凋亡检测
CCK-8检测的细胞密度、TUNEL实验的固定和透化条件
阅读提示:Materials and Methods 4.2 CCK-8 Assay 和 4.3 TUNEL Assay;Figure 1 和 2 的图注
氧化应激与线粒体功能检测
ROS检测的DCFH-DA浓度和孵育时间、MDA和SOD检测的细胞处理、JC-1染色的孵育时间
阅读提示:Materials and Methods 4.4 Measurement of ROS, MDA and SOD Activity 和 4.7 MMP Detection
能量代谢检测
ATP、葡萄糖、丙酮酸、乳酸检测的样品制备方法,PKM和LDHA活性检测的样品制备
阅读提示:Materials and Methods 4.8 Measurement of ATP, 4.9 Determination of Glucose, Pyruvate, and Lactic Acid Levels, 4.10 Measurement of PKM and LDHA Activity
转录组分析
RNA-seq的生物学重复数、差异表达阈值、KEGG富集分析方法
阅读提示:Materials and Methods 4.12 RNA-Seq and Transcriptome Data Analysis