数据获取与预处理
获取LUAD转录组和临床数据，筛选符合条件的样本。
从TCGA下载539个LUAD和59个正常样本的转录组数据（TPM格式）及临床和突变数据，筛选503个肿瘤样本；从GEO下载单细胞数据集GSE207422。
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基于核苷酸代谢的肺腺癌分子亚型及生物标志物的综合生物信息学分析
Integrated bioinformatics analysis of nucleotide metabolism based molecular subtyping and biomarkers in lung adenocarcinoma.
实验完整度
高多层级证据包括TCGA和单细胞测序数据挖掘、细胞系体外功能实验（RT-qPCR、Western blot、CCK-8、Transwell、克隆形成）、动物体内实验（皮下成瘤及免疫荧光），并分析了临床样本免疫组化。
主要模型
肺腺癌细胞系A549、H1975 LLC小鼠肺癌细胞皮下移植瘤模型 TCGA-LUAD队列（503例） 单细胞RNA测序数据集GSE207422
重点核对
NMF聚类确定亚型数K=2 WGCNA模块与临床特征相关性（cut height=100,000, R2=0.9） 机器学习筛选28个特征基因 shRNA敲低AUNIP后细胞增殖、迁移能力的变化 LLC细胞皮下注射剂量（5×10^6细胞/只）及肿瘤体积测定
摘要
背景：肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌的主要亚型，由于其异质性和复杂的肿瘤微环境（TME），治疗结果仍面临挑战。核苷酸代谢失调已被确定为肿瘤发生的重要因素，提示其作为治疗靶点的潜力。方法：本研究利用癌症基因组图谱（TCGA）中的LUAD样本，采用非负矩阵分解（NMF）聚类、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和各种机器学习技术。通过大规模数据分析和单细胞测序，我们研究了核苷酸代谢在临床特征和免疫微环境中的作用。利用体内和体外实验，如RT-qPCR、Western Blot、免疫组化和小鼠皮下肿瘤形成，我们进一步验证了关键核苷酸代谢基因在细胞系和动物中的功能。结果：核苷酸代谢基因将LUAD患者分为两个具有显著预后差异的不同亚型。与活跃核苷酸代谢通路相关的'C1'亚型表现出较差的预后和更具侵袭性的肿瘤表型。此外，由28个关键基因表达计算的核苷酸代谢相关评分（NMRS）有效区分了患者预后，并预测了与致癌通路和免疫应答的关联。通过整合多种免疫浸润算法，我们描绘了核苷酸代谢特征基因与肿瘤微环境之间的关联，并通过分析免疫化疗相关的单细胞测序数据集，表征了它们在细胞水平上的分布差异。最后，我们证明了关键核苷酸代谢基因AUNIP的差异表达作为癌基因促进LUAD细胞增殖，并与肿瘤免疫浸润相关。结论：该研究强调了核苷酸代谢在LUAD进展和预后中的关键作用，突出了NMRS作为临床结局和治疗反应的有价值生物标志物。具体而言，AUNIP作为关键癌基因，为LUAD的新治疗策略提供了有希望的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 核苷酸代谢相关基因在肺腺癌中的表达模式、亚型分类及其与预后和免疫微环境的关系，以及关键基因AUNIP的生物学功能。
- 核心机制
- 核苷酸代谢活跃的C1亚型通过上调细胞周期、DNA复制等通路促进肿瘤进展，AUNIP作为癌基因促进LUAD细胞增殖和迁移，并与免疫抑制相关。
- 主要证据
- 基于TCGA数据NMF聚类和WGCNA分析，结合单细胞数据（GSE207422）显示NMRS特征基因在MPR组低表达；体外实验显示敲低AUNIP抑制A549和H1975细胞增殖、迁移，体内实验显示敲低AUNIP抑制LLC移植瘤生长并增加CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞浸润。
- 研究意义
- NMRS可作为LUAD预后和免疫治疗反应的生物标志物，AUNIP可能成为新治疗策略的靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基于NMF的核苷酸代谢亚型鉴定
基于核苷酸代谢基因表达将LUAD患者分为不同亚型，并评估预后差异。
对1070个核苷酸代谢相关基因表达谱进行NMF聚类（K=2-10），通过cophenetic、dispersion、silhouette确定最佳K值，比较亚型间OS和PFS。
WGCNA识别关键模块与特征基因筛选
识别与核苷酸代谢亚型及临床特征相关的基因模块，并筛选特征基因。
利用WGCNA对503个LUAD样本的编码基因构建共表达网络，识别与表型相关的模块（Blue模块），与预后相关核苷酸代谢基因取交集，并结合四种机器学习算法（KNN、LogitBoost、RF、SVM）筛选特征基因。
计算NMRS评分并评估其临床价值
基于特征基因构建NMRS评分，评估其与临床特征、通路活性和预后的关联。
对28个特征基因表达进行PCA降维，计算主成分综合评分NMRS，根据中位数将样本分为高、低NMRS组，比较两组间临床特征、经典通路活性、凋亡/细胞周期基因相关性及预后。
评估免疫微环境与免疫治疗反应
分析NMRS分组与免疫细胞浸润及免疫治疗反应的关系。
使用CIBERSORT和immunedeconv等算法估计免疫细胞丰度，ESTIMATE计算TME评分，TIDE评估免疫逃逸，IPS预测免疫检查点抑制剂反应；比较NMRS分组间的差异。
单细胞转录组分析
探究NMRS特征基因在免疫化疗前后肿瘤微环境不同细胞亚群中的分布和表达变化。
对GSE207422单细胞数据进行质控、聚类和注释，使用AUCell计算NMRS特征基因富集分数，比较TN、MPR、NMPR组间的差异，并进行GSEA分析。
验证AUNIP的功能
验证AUNIP在LUAD中的表达和功能。
通过Western blot和免疫组化检测AUNIP在细胞和组织中的表达；在A549和H1975细胞中敲低AUNIP，通过CCK-8、克隆形成、Transwell实验检测增殖和迁移；在C57小鼠中注射稳定敲低AUNIP的LLC细胞，观察肿瘤生长和免疫浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
样本分组与亚型鉴定
体内实验
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | 上海李飞实验室生物技术有限公司 | AC03L055 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| AUNIP抗体 | Bioss | bs-15019R | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| ECL底物 | -- | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Accurate Biotechnology | AG21102 |
| 反转录试剂盒 | Accurate Biotechnology | AG11728 | |
| PCR试剂盒 | Accurate Biotechnology | AG11701 | |
| 免疫组织化学 | DAB染色试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| CCK-8实验 | CCK-8试剂 | Beyotime | C0037 |
| 细胞培养 | A549细胞系 | Sunncell | SNL-257 |
| H1975细胞系 | Sunncell | SNL-087 | |
| LLC细胞系 | Sunncell | SNL-119 | |
| 动物实验 | C57BL/6j小鼠 | 湖南斯莱克景达实验动物有限公司 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据获取 | 样本纳入标准：TCGA LUAD样本，生存时间不为0且生存状态明确，最终503个样本。 阅读提示：Methods 2.1 |
| NMF聚类 | 基因集：1070个核苷酸代谢相关基因；NMF聚类方法（'brunet'），聚类数K=2。 阅读提示：Methods 2.2 |
| WGCNA分析 | 软阈值选择（R2=0.9），cut height=100,000，表型包括亚型、生存时间、生存状态、肿瘤分期。 阅读提示：Methods 2.3 |
| 特征基因筛选 | 四种机器学习算法（KNN、LogitBoost、RF、SVM）的特征重要性排序，最终28个特征基因。 阅读提示：Methods 2.4 |
| NMRS计算 | PCA降维基于28个特征基因，以中位数分高、低组。 阅读提示：Methods 2.5 |
| 单细胞分析 | GSE207422数据集，细胞过滤标准（基因数>500，线粒体<20%，核糖体<50%），细胞类型注释标记基因。 阅读提示：Methods 2.7 |
| 细胞培养 | 细胞系A549、H1975、LLC的培养基（RPMI-1640或DMEM）、10%FBS、1%抗生素，37°C, 5% CO2。 阅读提示：Methods 2.9 |
| Western blot | 一抗稀释度：AUNIP 1:1000, GAPDH 1:10000, β-actin 1:5000；转膜PVDF膜0.45μm；ECL曝光。 阅读提示：Methods 2.10 |
| RT-qPCR | 引物序列；β-actin作为内参；2^-ΔΔCt法计算。 阅读提示：Methods 2.11 |
| CCK-8实验 | 细胞接种密度（1×10^4/孔），CCK-8试剂10μL/孔，孵育1小时，测450nm，连续5天。 阅读提示：Methods 2.13 |
| Transwell和克隆形成 | Transwell上室2×10^4细胞/孔，下室500μL 8% FBS培养基，培养24小时；克隆形成1000细胞/孔，14天，每2天换液。 阅读提示：Methods 2.14 |
| 动物实验 | 6周龄雄性C57BL/6j小鼠，LLC细胞（5×10^6）皮下注射100μL PBS，每3天测量肿瘤，15天后处死。 阅读提示：Methods 2.15 |