构建脾脏内皮细胞单细胞转录组图谱
鉴定年轻和年老小鼠脾脏内皮细胞的亚群及其分子特征。
从年轻（2月龄）和年老（2岁）C57BL/6小鼠脾脏中分离内皮细胞，进行scRNA-seq，经质控后共获得10,467个内皮细胞（年轻:5,053，年老:5,414），聚类后鉴定出10个亚群。
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通过单细胞RNA测序分析揭示衰老对脾脏内皮细胞异质性和免疫衰老的影响
Deciphering the impact of aging on splenic endothelial cell heterogeneity and immunosenescence through single-cell RNA sequencing analysis.
实验完整度
中主要基于scRNA-seq分析和生物信息学验证（如免疫荧光、FISH、拟时间分析、细胞通讯分析），缺乏功能实验和机制验证，如基因敲除或过表达实验。
主要模型
年轻（2月龄）和年老（2岁）雌性C57BL/6小鼠脾脏内皮细胞 其他小鼠器官（心脏、肝脏、肾脏）内皮细胞 人类脾脏内皮细胞（Tabula Sapiens数据集）
重点核对
小鼠模型：6-8周龄（年轻）和24月龄（年老）野生型C57BL6/J小鼠，雌性 内皮细胞富集：CD31微珠（Miltenyi Biotec, #130-097-418） scRNA-seq建库：Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v2（10x Genomics），目标回收5000个细胞 测序平台：Illumina HiSeq 4000，比对到小鼠基因组mm10 质控标准：排除基因数<200或>4000的细胞，以及线粒体UMI比例>10%的细胞
摘要
背景：衰老与脾脏的显著结构和功能变化相关，导致免疫衰老，然而衰老对脾血管内皮细胞（ECs）及其免疫调节作用的详细影响尚未完全明确。本研究构建了年轻和年老小鼠脾脏内皮细胞转录组的单细胞RNA（scRNA）图谱，以揭示与年龄相关的分子变化，包括炎症增加和血管发育减少，以及脾脏内皮细胞与免疫细胞之间的潜在相互作用。结果：鉴定出十个脾脏内皮细胞亚群。对不同内皮细胞亚群的差异表达基因分析揭示了衰老相关的分子变化，显示老年内皮细胞整体炎症微环境增加和血管发育功能丧失。值得注意的是，鉴定了四个具有免疫功能的内皮细胞亚群，提示可能存在由衰老驱动的内皮向免疫样细胞转变（EndICLT）。对Immunology4亚群的拟时间分析进一步提示了一种可能的衰老诱导的过渡状态，可能由Ctss基因激活启动。最后，分析了衰老对不同内皮细胞亚群与免疫细胞之间细胞信号通讯的影响。结论：该综合图谱阐明了衰老脾脏中内皮细胞与免疫细胞之间的复杂相互作用，为内皮细胞异质性、重编程和免疫衰老机制提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 衰老如何影响脾脏内皮细胞的异质性及其与免疫细胞的相互作用，从而促进免疫衰老？
- 核心机制
- 衰老可能通过激活Ctss基因启动内皮向免疫样细胞转变（EndICLT），导致内皮细胞获得免疫细胞样表型，同时伴随炎症信号增强和血管发育功能丧失。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序鉴定出四个具有免疫功能的EC亚群（Immunology1-4），与特定免疫细胞相关；拟时间分析显示衰老诱导Immunology4进入过渡状态，并鉴定出Ctss作为潜在调节基因；细胞通讯分析显示衰老中炎症通路（如Ccl、Cxcl）上调。
- 研究意义
- 该研究提供了衰老脾脏内皮细胞异质性和重编程的新见解，有助于理解免疫衰老的机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析衰老相关的差异表达基因（DEGs）
揭示衰老对内皮细胞分子功能的影响。
使用Seurat的FindMarkers函数（Wilcox检验）比较年老和年轻组，鉴定上调和下调的DEGs，并进行GO和KEGG富集分析。
鉴定功能特征和免疫相关亚群
验证四个免疫相关EC亚群的免疫调节功能及其与免疫细胞的相似性。
通过基因集评分（IRG、ICH、抗原呈递、过敏、B细胞活化、吞噬）、与免疫细胞的标记基因重叠和相关性分析，以及免疫荧光和FISH验证。
拟时间轨迹分析
探索免疫相关EC亚群是否处于内皮细胞向免疫细胞转变的中间状态，以及衰老对轨迹的影响。
使用Monocle2对四种免疫相关EC亚群及其相关免疫细胞进行拟时间分析，并分别对年轻和年老Immunology4相关亚群进行轨迹分析，结合cellAlign比较。
共表达网络分析
识别衰老诱导的EndICLT过程中的关键调控基因和模块。
在年老Immunology4相关亚群的轨迹中，使用hdWGCNA进行共表达网络分析，鉴定模块和hub基因，并与分支点高表达基因重叠。
细胞通讯分析
分析衰老对脾脏内皮细胞与免疫细胞之间信号通讯的影响。
使用CellChat分析年轻和年老组中ECs与免疫细胞（DC、肥大细胞、B细胞、巨噬细胞）的配体-受体相互作用，比较信号强度和通路。
跨器官和人类验证
验证免疫相关内皮细胞在其他小鼠器官和人类脾脏中的存在。
分析来自其他研究的小鼠心脏、肝脏和肾脏scRNA-seq数据，以及人类脾脏内皮细胞数据（Tabula Sapiens），鉴定免疫相关EC亚群并比较marker基因和功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
构建单细胞转录组图谱
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | 胶原酶II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 |
| 胶原酶IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | A5669701 |
| 细胞分离 | CD31微珠 | Miltenyi Biotec | 130-097-418 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | GIBCO | C11330500BT |
| 细胞分离 | 细胞过滤器 | Sigma-Aldrich | CLS431750-50EA |
| 免疫荧光 | CD31一抗 | Servicebio | GB120005-100 |
| 山羊抗兔AF488 | abcam | ab150081 | |
| 抗CD31抗体 | Thermo Fisher | PA5-32321 | |
| 山羊抗兔AF488 | Thermo Fisher | A-11008 | |
| 抗生物素FITC偶联物 | Bioss | BS-0437P-FITC | |
| scRNA-seq建库 | Chromium单细胞3'试剂盒v2 | 10x Genomics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系：C57BL6/J；年龄：年轻（6-8周）和年老（24个月）；性别：雌性（文中未明确说明性别，但Results中提及4只年轻和4只年老，均为雌性） 阅读提示：Methods - Animals |
| 内皮细胞分离 | 消化酶：0.1%胶原酶II、0.25%胶原酶IV、2 mg/mL DNase I；消化时间：37°C水浴15分钟；终止：10% FBS；过滤：40 μm细胞过滤器；离心：300g 5分钟；富集：CD31微珠（Miltenyi Biotec, #130-097-418） 阅读提示：Methods - Spleen ECs collection |
| scRNA-seq建库与测序 | 建库试剂盒：Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v2；目标回收5000个细胞；测序平台：Illumina HiSeq 4000；比对基因组：mm10；CellRanger版本2.1.1 阅读提示：Methods - Library preparation and sequencing |
| 数据质控 | 基因数<200或>4000的细胞排除；线粒体UMI比例>10%的细胞排除；基因表达少于3个细胞或行平均值<0.002的基因排除 阅读提示：Methods - Quality control of scRNA-seq data |
| 聚类分析 | 聚类参数：resolution=0.3，k-nearest neighbors=20；marker基因筛选：min.pct>0.25，logfc.threshold>0.25 阅读提示：Methods - Clustering and identification of cell types |
| 免疫荧光和FISH | CD31抗体稀释比1:200（Servicebio, GB120005-100）；mRNA探针浓度1 μM；DAPI染色8分钟；显微镜：Nikon upright fluorescence microscope 阅读提示：Methods - Immunofluorescence staining |