AIM2炎性小体诱导的焦亡对急性痛风性关节炎和无症状高尿酸血症患者的影响

The impact of AIM2 inflammasome-induced pyroptosis on acute gouty arthritis and asymptomatic hyperuricemia patients.

作者信息Jiyan Chu, Jing Tian, Ping Li, Diyu Fu, Lin Guo, Rui Sun
PMID39100670
发布时间2024-07-19
DOI10.3389/fimmu.2024.1386939

实验完整度

中

研究包含临床队列样本(AGA、AHU、HC)的分子表达检测(qRT-PCR、Western blot、ELISA)及血清dsDNA定量,但以相关性分析为主,缺乏功能验证和动物模型。

主要模型

急性痛风性关节炎(AGA)患者外周血单核细胞(PBMC) 无症状高尿酸血症(AHU)个体外周血单核细胞(PBMC) 健康对照(HC)外周血单核细胞(PBMC)

重点核对

样本分组:AGA组30例、AHU组30例、HC组30例,男性,年龄18-70岁 血清dsDNA定量:使用Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂盒(Invitrogen) mRNA检测:RT-qPCR检测AIM2、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18,以GAPDH为内参,2-ΔΔCT法分析 蛋白检测:Western blot检测AIM2、Caspase-1等,使用BCA法测定蛋白浓度 血清细胞因子:ELISA检测IL-1β和IL-18,重复样本分析

摘要

目的:本研究旨在评估黑色素瘤缺失因子2(AIM2)炎性小体介导的焦亡在急性痛风性关节炎(AGA)和无症状高尿酸血症(AHU)发病机制中的作用。方法:共纳入30例AGA患者、30例AHU个体和30例健康对照(HC)。收集人口统计学和生化数据以及血液样本。使用荧光测定法定量血清双链DNA(dsDNA)水平。通过qRT-PCR和Western blot对外周血单核细胞中AIM2、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18进行转录组和蛋白质组分析。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清IL-1β和IL-18。使用Spearman相关性分析评估变量之间的关系。结果:与HC组相比,AGA和AHU组均表现出代谢指标以及血清dsDNA、IL-1β和IL-18水平升高。AGA患者的炎症标志物高于AHU组。在AGA组中,AIM2、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05至P<0.001)。AHU组的AIM2、Caspase-1、GSDMD和IL-18 mRNA水平高于HC组(P<0.001至P<0.01),而AIM2、GSDMD和IL-1β蛋白升高不显著(P>0.05)。相反,AHU组的Caspase-1和IL-18蛋白显著升高(P<0.05)。在AGA和AHU组中均观察到AIM2蛋白表达与Caspase-1和GSDMD水平之间存在显著相关性。在AGA组中,AIM2蛋白与IL-1β相关,但在AHU组中不相关。AHU组中的AIM2蛋白与IL-18呈正相关,而在AGA组中没有这种相关性。结论:AIM2炎性小体可能在AGA和AHU的炎症过程中发挥作用,其激活可能与焦亡通路有关。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
AIM2炎性小体介导的焦亡通路是否参与急性痛风性关节炎(AGA)和无症状高尿酸血症(AHU)的发病机制?
核心机制
AIM2炎性小体可能通过识别dsDNA激活Caspase-1,裂解GSDMD形成膜孔,促进IL-1β和IL-18成熟释放,参与焦亡通路,从而在AGA和AHU的炎症过程中发挥作用。
主要证据
在AGA和AHU患者PBMCs中检测到AIM2、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白表达升高,且血清中dsDNA、IL-1β和IL-18水平升高;AIM2蛋白与Caspase-1、GSDMD呈正相关。
研究意义
研究表明AIM2炎性小体介导的焦亡通路可能为AGA的治疗提供潜在靶点,并强调其在无症状高尿酸血症中的潜在作用。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

临床样本收集与分组

比较AGA、AHU与健康对照的临床和生化特征。

收集90名男性参与者(30例AGA、30例AHU、30例HC)的临床资料和血液样本,进行血常规、生化指标检测。

2

血清dsDNA水平检测

评估各组血清dsDNA水平是否不同。

使用Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂盒进行荧光定量检测血清dsDNA浓度。

3

PBMCs中目的基因mRNA表达检测

比较各组PBMCs中AIM2、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的mRNA水平。

提取全血总RNA,逆转录cDNA,进行实时PCR扩增,以GAPDH为内参,用2-ΔΔCT法分析表达水平。

4

PBMCs中目的蛋白表达检测

比较各组PBMCs中AIM2、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的蛋白水平。

提取PBMCs总蛋白,BCA法测定浓度,SDS-PAGE电泳,转膜,抗体孵育,ECL显色,Image J分析条带强度。

5

血清炎症因子检测

比较各组血清IL-1β和IL-18浓度。

使用ELISA试剂盒检测血清IL-1β和IL-18浓度,于450 nm处读取OD值。

6

相关性分析

评估dsDNA水平与临床指标、AIM2蛋白与炎性小体组分及炎症因子的相关性。

对dsDNA水平与BMI、TG、UA等指标进行Spearman相关分析;对AIM2蛋白与Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白进行相关分析。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂盒Invitrogen--
BioTek Synergy2多功能酶标仪BioTek--
全血总RNA提取试剂盒IVDSHOW--
逆转录试剂盒TaKaRa--
Applied Biosystems 7500实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--
BCA蛋白定量试剂盒Absinabs9232
SDS-PAGE凝胶Epizyme ScientificPG112
SDS-PAGE凝胶Epizyme ScientificPG113
AIM2抗体Absinabs125828
Caspase-1抗体Cell Signaling Technology3866
GSDMD抗体BiossP57764
IL-1β抗体Cell Signaling Technology12703
IL-18抗体Cell Signaling Technology54943
GAPDH抗体ServicebioGB15004
HRP标记的山羊抗兔IgG抗体ServicebioGB23303
ECL化学发光试剂盒Absinabs920
GE AI 680超灵敏多功能成像系统GE--
人IL-18 ELISA试剂盒Meimian0139H1
人IL-1β ELISA试剂盒Meimian0181H1
Rayto RT-6100酶标仪Rayto--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样本收集与分组
样本来源:北部战区总医院门诊;AGA诊断基于2015年ACR/EULAR标准;AHU基于高尿酸血症标准;HC为体检者;年龄性别匹配;排除标准;样本量:每组30例。
阅读提示:见Materials and Methods中Participants and samples部分
血清dsDNA检测
试剂盒:Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit;血清体积;PicoGreen稀释倍数;孵育时间;激发/发射波长;酶标仪型号。
阅读提示:见Materials and Methods中Fluorescent quantification部分
mRNA表达检测
RNA提取试剂盒;逆转录试剂盒;引物序列;内参基因GAPDH;RT-PCR系统;热循环条件;数据分析方法(2-ΔΔCT)。
阅读提示:见Materials and Methods中Total RNA isolation and real-time PCR analysis部分
蛋白表达检测
蛋白提取方法;BCA试剂盒;SDS-PAGE凝胶浓度;一抗信息(克隆号、稀释比);二抗信息;ECL试剂盒;成像系统。
阅读提示:见Materials and Methods中Western blotting部分及Figure 3关注n值
血清细胞因子检测
ELISA试剂盒货号;样本重复数;OD值读取波长;酶标仪型号。
阅读提示:见Materials and Methods中ELISA部分
统计分析
统计软件版本;正态性检验方法;t检验、Mann-Whitney U检验、单因素方差分析的使用条件;Spearman相关性分析;显著性水平P<0.05。
阅读提示:见Materials and Methods中Statistical analysis部分