构建脂肪细胞特异性FAK敲除小鼠并验证敲除效率
生成FAK-AKO小鼠并确认脂肪组织中FAK的特异性缺失，为后续研究提供动物模型。
将FAK floxed小鼠与Adipoq-Cre小鼠杂交生成FAK-AKO小鼠，通过Western blot检测IngWAT、EpiWAT及其他组织中FAK表达，验证敲除效率。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
脂肪细胞特异性FAK缺失通过脂肪组织炎症反应促进胰腺β细胞凋亡，加重糖尿病
Adipocyte-specific FAK deletion promotes pancreatic β-cell apoptosis via adipose inflammatory response to exacerbate diabetes mellitus.
实验完整度
高文献包含体内动物模型（FAK-AKO和STZ诱导糖尿病模型）及体外细胞实验（3T3-L1、RAW264.7、Min6），并进行了功能验证（凋亡、炎症）和机制验证（TRAF6/TAK1/NF-κB），符合高完整度标准。
主要模型
FAK-AKO小鼠 STZ诱导的糖尿病小鼠模型 3T3-L1脂肪细胞 RAW264.7巨噬细胞 Min6胰腺β细胞
重点核对
FAK-AKO小鼠的构建（Adipoq-Cre与FAK flox/flox杂交） STZ诱导糖尿病模型的剂量（40 mg/kg，连续5天）和给药方式（腹腔注射） 3T3-L1分化过程中FAK siRNA、FAK OE或FAK抑制剂处理的时间点（分化第4天） RAW264.7巨噬细胞与3T3-L1共培养的刺激条件（100 ng/mL LPS或10 ng/mL IL-4，48小时） Min6细胞处理的条件培养基和STZ浓度（10 mM，48小时）
摘要
背景：白色脂肪组织在维持全身能量平衡中起关键作用，其功能障碍参与糖尿病的调节。然而，其内部调控机制仍不清楚。方法和结果：我们生成了脂肪细胞特异性FAK敲除小鼠并研究其表型。在FAK-AKO小鼠中提出了脂肪细胞、脂肪组织中的巨噬细胞和胰腺β细胞的级联反应，并通过使用3T3-L1、Raw264.7和Min6的细胞系研究进行了验证。FAK-AKO小鼠表现出葡萄糖不耐受、脂肪组织质量减少以及脂肪组织中凋亡、脂解和炎症反应增加。我们进一步证明，脂肪细胞FAK缺失增加β细胞凋亡和胰岛炎症浸润，如果小鼠用STZ处理则加剧。在STZ诱导的糖尿病模型中，FAK AKO小鼠表现出更少的血清胰岛素含量和胰腺β细胞面积。此外，在FAK AKO小鼠中，葡萄糖刺激后血清促炎因子增加，胰岛素水平降低。在平行的体外实验中，分化过程中敲低或抑制FAK也增加了3T3-L1脂肪细胞的凋亡、脂解和炎症，而FAK过表达则观察到相反的效果。此外，将LPS处理的RAW264.7巨噬细胞与敲低FAK的3T3-L1脂肪细胞共培养增加了巨噬细胞的促炎反应。此外，上述条件培养基刺激Min6细胞凋亡（有或没有STZ），而FAK过表达则相反。机制上，FAK蛋白在脂肪细胞中与TRAF6相互作用，敲低或抑制FAK激活TRAF6/TAK1/NF-κB信号，加剧脂肪细胞自身的炎症。结论：脂肪细胞FAK缺失促进脂肪细胞凋亡和脂肪组织炎症。FAK缺失的脂肪组织释放的促炎因子进一步触发STZ给药诱导的胰岛凋亡，从而加重糖尿病。这项研究揭示了FAK介导的脂肪炎症与糖尿病之间的联系，这一机制以前未被认识到。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脂肪细胞FAK缺失如何通过影响脂肪组织炎症反应进而影响糖尿病（尤其是1型糖尿病）的发病进程？
- 核心机制
- 脂肪细胞FAK缺失激活TRAF6/TAK1/NF-κB信号通路，促进脂肪细胞自身凋亡和炎症反应，释放TNF-α、IL-1β等促炎因子，这些因子进一步激活M1型巨噬细胞，加剧脂肪组织炎症，并随血液循环至胰腺，诱导β细胞凋亡，加重STZ诱导的糖尿病。
- 主要证据
- FAK-AKO小鼠表现出葡萄糖不耐受、脂肪组织质量减少和炎症增加；体外实验中FAK敲低或抑制增加脂肪细胞凋亡和炎症，而FAK过表达则相反；共培养实验显示FAK敲低脂肪细胞促进M1巨噬细胞极化；条件培养基促进Min6细胞凋亡；Western blot和Co-IP验证了TRAF6/TAK1/NF-κB通路及FAK-TRAF6相互作用。
- 研究意义
- 本研究揭示了脂肪组织FAK介导的炎症与糖尿病之间的联系，为糖尿病（尤其是T1D）的治疗提供了新的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估FAK-AKO小鼠的代谢表型
明确脂肪细胞FAK缺失对脂肪组织质量、葡萄糖耐量和胰岛素敏感性的影响。
对FAK-AKO和WT小鼠进行体重、BMI、腰围、体长、摄食量、饮水量检测，测量脂肪组织重量体积，进行micro-CT扫描、GTT、ITT和代谢笼分析。
分析脂肪组织形态和细胞凋亡
探究FAK缺失引起脂肪质量减少的细胞机制，即是否通过促进凋亡或影响脂肪细胞数量。
对IngWAT和EpiWAT进行HE染色、TUNEL染色、Western blot检测cleaved Caspase3，并统计脂肪细胞数量和面积；在3T3-L1细胞中通过siRNA敲低、抑制剂处理或过表达FAK，检测凋亡相关指标。
评估脂肪组织炎症反应和脂解水平
明确FAK缺失对脂肪组织炎症和脂解的影响，并验证是否由脂肪细胞自身炎症引起。
通过IHC检测F4/80标记巨噬细胞浸润和CLS形成，qPCR和Western blot检测炎症因子表达，ELISA检测细胞上清中TNF-α、IL-1β、MCP1；同时检测脂解相关蛋白HSL、ATGL表达。
验证FAK通过TRAF6/TAK1/NF-κB通路调控炎症
探究FAK调控脂肪细胞炎症的分子机制，并验证FAK与TRAF6的相互作用。
利用STRING数据库分析FAK相互作用蛋白，进行KEGG通路富集；通过Western blot检测TRAF6、p-TAK1、NF-κB p-p65等蛋白水平，Co-IP验证FAK与TRAF6结合；通过FAK和TRAF6双敲低进一步验证通路。
评估FAK缺失对巨噬细胞极化的影响
探究脂肪细胞分泌的炎症因子是否促进巨噬细胞M1极化，从而加剧脂肪组织炎症。
将FAK敲低或过表达的3T3-L1脂肪细胞与RAW264.7巨噬细胞共培养，并用LPS或IL-4刺激，检测巨噬细胞炎症基因表达、M1/M2巨噬细胞比例及上清炎症因子水平。
验证脂肪细胞FAK缺失对β细胞的影响
探究FAK缺失脂肪细胞释放的炎症因子是否能诱导β细胞凋亡，并解释FAK-AKO小鼠的葡萄糖不耐受。
分析FAK-AKO小鼠胰腺的组织学变化（HE、胰岛素IHC、TUNEL），检测血清胰岛素水平；体外用FAK敲低脂肪细胞与LPS处理的巨噬细胞共培养的条件培养基处理Min6细胞，检测凋亡。
评估FAK缺失对STZ诱导糖尿病模型的影响
确定FAK缺失是否加重STZ诱导的T1D发展，并验证炎症因子在其中的作用。
对FAK-AKO和WT小鼠注射STZ诱导糖尿病，监测血糖、糖尿病发病率、GTT、血清胰岛素和炎症因子；分析胰腺的组织学和免疫细胞浸润；体外用条件培养基和STZ处理Min6细胞检测凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 链脲佐菌素 | HARVEYBIO | -- |
| 脂肪组织IHC | 抗F4/80抗体 | CST | 70076S |
| 免疫组化 | DAB显色液 | Biosharp | BL732A |
| 抗胰岛素抗体 | ABclonal | A2090 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素和链霉素 | -- | -- | |
| 细胞分化诱导 | 胰岛素 | -- | -- |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | -- | -- | |
| 细胞处理 | FAK抑制剂 | MCE | -- |
| 转染 | Lipofectamine™ 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | β-巯基乙醇 | Gibco | -- |
| 巨噬细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma | -- |
| 白细胞介素-4 | SinoBiological | -- | |
| 细胞培养 | 6孔板 | -- | -- |
| 细胞培养小室（0.4 µm） | LABSELECT | -- | |
| Min6细胞培养 | 培养板 | Corning | -- |
| 流式细胞术 | FITC标记抗CD3抗体 | Elabscience | E-AB-F1013C |
| APC标记抗CD8抗体 | Biolegend | 140419 | |
| PE标记抗CD4抗体 | Elabscience | E-AB-F1097D | |
| PE标记抗F4/80抗体 | Elabscience | E-AB-F0995G | |
| APC标记抗CD11b抗体 | Elabscience | E-AB-F1081E | |
| FITC标记抗CD11c抗体 | Elabscience | E-AB-F0991C | |
| APC标记抗CD206抗体 | Elabscience | E-AB-F1135E | |
| APC-CY7标记抗B220抗体 | BD | 561037 | |
| AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A211 | |
| DxFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | cytoflex | |
| EdU增殖检测 | EdU检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A376 |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | -- | -- | |
| TUNEL凋亡检测 | TUNEL检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A320 |
| 脂肪组织TUNEL | 抗Perilipin 1抗体 | Bioss | bs-3789R |
| 载体构建 | MultiF无缝组装试剂盒 | Biomarker | RK02003 |
| qPCR | TRIzol试剂 | Takara | RNAiso |
| PrimeScript™逆转录试剂盒 | Takara | RR047Q | |
| SYBR Green qPCR预混液 | Takara | RR820R | |
| CFX96™实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 抗TNF-α抗体 | Beyotime | AF8208 | |
| 抗裂解Caspase 3抗体 | CST | 9664S | |
| 抗FAK抗体 | CST | 3285S | |
| 抗TRAF2抗体 | ABclonal | A0962 | |
| 抗TRAF6抗体 | ABclonal | A0973 | |
| 抗磷酸化TAK1抗体 | CST | 9339S | |
| 抗TAK1抗体 | CST | 5206S | |
| 抗NF-κB p65抗体 | CST | 8242S | |
| 抗磷酸化NF-κB p65抗体 | CST | 3033S | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Biopm | PMK181 | |
| ECL化学发光底物 | HYCEZMBIO | HYC0316 | |
| 免疫共沉淀 | RIPA裂解液（用于免疫共沉淀） | Beyotime | P0013D |
| ELISA | 胰岛素ELISA试剂盒 | ELK Biotechnology | ELK1981 |
| TNF-α ELISA试剂盒 | ELK Biotechnology | ELK1387MS | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | ELK Biotechnology | ELK1271MS | |
| MCP1 ELISA试剂盒 | ELK Biotechnology | ELK1271MS |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | FAK floxed小鼠（来自Cyagen Biotechnology）与Adipoq-Cre小鼠杂交，背景为C57BL/6J；雄性小鼠。 阅读提示：Methods 2.1动物实验 |
| STZ诱导糖尿病模型 | 8周龄雄性小鼠腹腔注射STZ（40 mg/kg，HARVEYBIO）连续5天；糖尿病标准为空腹血糖>11.1 mM。 阅读提示：Methods 2.1动物实验 |
| 葡萄糖耐量试验（GTT） | 禁食14小时后腹腔注射D-葡萄糖（2 g/kg）；测量0、15、30、60、120分钟血糖和胰岛素。 阅读提示：Methods 2.1动物实验 |
| 胰岛素耐量试验（ITT） | 禁食4小时后腹腔注射胰岛素（0.75 U/kg）；测量0、15、30、60、120分钟血糖。 阅读提示：Methods 2.1动物实验 |
| 3T3-L1分化和处理 | 3T3-L1细胞分化：胰岛素（10 µg/mL）、地塞米松（1 µM）、IBMX（0.5 mM）处理2天，随后用10 µg/mL胰岛素培养至第8天；在第4天进行siRNA转染（FAK siRNA、TRAF6 siRNA）、FAK OE或FAK抑制剂（5 µM）处理。 阅读提示：Methods 2.5.1和2.5.3 |
| 巨噬细胞共培养 | RAW264.7细胞接种于0.4 µm小室，与分化第8天的3T3-L1共培养，并用100 ng/mL LPS或10 ng/mL IL-4刺激48小时。 阅读提示：Methods 2.5.2和2.5.3 |
| Min6细胞处理 | Min6细胞用条件培养基（1:1混合）或10 mM STZ处理48小时；条件培养基来自巨噬细胞和脂肪细胞共培养的上清。 阅读提示：Methods 2.5.3和2.5.4 |
| 免疫细胞流式 | 从PLN和胰腺分离单细胞，抗体：FITC-CD3、APC-CD8、PE-CD4、PE-F4/80、APC-CD11b、FITC-CD11c、APC-CD206、APC-CY7-B220。 阅读提示：Methods 2.6流式细胞术 |