建立PRRSV高通量筛选模型
开发基于表型的筛选系统，用于识别抑制PRRSV感染的化合物。
构建Marc-145-GFP报告细胞系，该细胞系在PRRSV感染后表达GFP。将化合物、GSWW-18病毒（MOI=1）和细胞共孵育，通过荧光检测评估抗病毒活性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
高通量筛选揭示硝唑尼特通过靶向NMRAL1作为有效的PRRSV抑制剂
High-throughput screening unveils nitazoxanide as a potent PRRSV inhibitor by targeting NMRAL1.
实验完整度
高包含体外细胞筛选、体内猪模型验证、机制研究（靶点鉴定、二聚化验证）等独立证据层级，且包含功能验证和机制验证。
主要模型
Marc-145-GFP报告细胞系 Marc-145细胞 猪肺泡巨噬细胞（PAM） 猪模型（Landrace猪）
重点核对
NTZ给药剂量（25、10、5 mg/kg）及给药方案（预防性-1 dpi、治疗性3 dpi，口服BID×3天） PRRSV感染剂量（1×10^5.5 TCID50，通过鼻内途径） EC50值（VR2332约0.67 μM，GSWW-15约1.17 μM） NMRAL1敲低和过表达对PRRSV复制的影响 TIZ与NMRAL1的结合亲和力（SPR KD约2.872 μM）
摘要
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）对全球养猪业构成重大威胁，但有效的防控措施仍然难以实现。本研究揭示了硝唑尼特（NTZ）在体外和体内均是PRRSV的有效抑制剂。通过高通量筛选技术，从包含FDA批准和药典药物的库中鉴定出16种潜在的抗PRRSV化合物。我们表明，NTZ在猪模型中显示出强大的降低PRRSV增殖和传播的功效，减轻病毒血症和肺损伤。此外，NTZ的主要代谢物替唑尼特（TIZ）被鉴定为NMRAL1二聚化的促进因子。这一发现可能有助于阐明TIZ在增强IFN-β通路敏感性中的作用机制。这些结果表明NTZ作为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的重新定位治疗药物具有广阔潜力。此外，它们为NTZ有效性的抗病毒机制提供了宝贵的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 寻找能够有效控制PRRSV流行的抗病毒策略，特别是通过高通量筛选发现候选药物并阐明其作用机制。
- 核心机制
- NTZ的主要代谢物TIZ通过诱导NMRAL1二聚化，减少抑制性单体的丰度，从而增强RIG-I通路敏感性并提高IFN-β表达，抑制PRRSV复制。
- 主要证据
- 体外实验显示NTZ抑制PRRSV复制，体内猪模型显示NTZ降低病毒血症和肺损伤；机制研究中，iTSA和CETSA-WB鉴定出NMRAL1为靶点，SPR和DSF证实TIZ与NMRAL1结合，过表达/敲低NMRAL1影响病毒复制，且TIZ促进NMRAL1二聚化。
- 研究意义
- NTZ作为已批准药物，具有快速重新定位为PRRS治疗剂的潜力，其作用机制的阐明有助于开发类似抗病毒药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选化合物的剂量反应和细胞毒性评估
验证初筛得到的候选化合物的抗病毒活性和细胞毒性，以确定优先化合物。
对初筛得到的141种化合物进行浓度梯度筛选，使用IFA检测抗病毒效果，并测定EC50和CC50。
体内评价NTZ的抗病毒效果
评估NTZ在猪模型中预防和治疗PRRSV感染的功效。
用GSWW-18株感染猪，分别进行预防性（-1 dpi）和治疗性（3 dpi）口服NTZ给药，检测病毒载量、临床评分、肺损伤等指标。
NTZ对病毒传播的抑制
评估NTZ是否减少PRRSV在猪群间的传播。
感染猪和未感染猪混合饲养，给予不同剂量NTZ，监测病毒脱落和传播。
鉴定NTZ的靶蛋白
揭示NTZ抑制PRRSV的分子靶点。
使用iTSA、CETSA-WB和CCR方法鉴定NTZ的潜在靶蛋白，包括宿主蛋白NMRAL1和病毒蛋白NSP1α、NSP12。
验证NTZ通过靶向NMRAL1的机制
验证NMRAL1在NTZ抗病毒作用中的功能角色，并阐明分子机制。
通过过表达和沉默NMRAL1检测PRRSV复制变化，并检测NTZ对NMRAL1二聚化和IFN-β通路的影响。使用DSF和SPR验证结合。
分子对接和动力学模拟
从结构上阐明TIZ与NMRAL1二聚体的结合模式和稳定性作用。
进行分子对接和分子动力学模拟，分析TIZ与NMRAL1的结合位点、结合自由能及二聚体构象变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
分子表达检测
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 杀稻瘟菌素S | Solarbio | B9300 | |
| 药物处理 | 硝唑尼特 | Aladdin | N159057 |
| 替唑尼特 | Aladdin | T343906 | |
| 利巴韦林 | Aladdin | R101754 | |
| 药物筛选 | FDA批准及药典药物库 | MCE | HY-L066 |
| 高通量筛选 | Cytell细胞成像系统 | GE | 29-0567-49 |
| 流式分析 | CytoFLEX LX流式细胞仪 | Beckman | -- |
| 转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus | -- |
| 分子克隆 | pLenti6/V5-DEST载体 | Youbio | VT1476 |
| pSPAX2载体 | Youbio | VT1444 | |
| pMD2.G载体 | Youbio | VT1443 | |
| pCMV-HA载体 | Youbio | VT1710 | |
| 荧光素酶报告实验 | Luc-IFN-β报告质粒 | Yeasen | -- |
| pTK-RL质粒 | Yeasen | -- | |
| 免疫检测 | SR30抗体 | Rtilab | SR30-A |
| 山羊抗小鼠HRP二抗 | Bioss | bs-0368G-HRP | |
| 山羊抗小鼠FITC二抗 | Bioss | bs-0368G-FITC | |
| 免疫印迹 | 兔抗GATM抗体 | Sigma | HPA026077 |
| 兔抗NMRAL1抗体 | Solarbio | K004351P | |
| 小鼠抗HA抗体 | Abmart | 26D11 | |
| 小鼠抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004 | |
| 兔抗PRRSV-N抗体 | Bioss | bs-41387R | |
| 山羊抗小鼠HRP偶联物 | Bio-rad | 1705047 | |
| 山羊抗兔HRP偶联物 | Bio-rad | 1705046 | |
| 药物处理 | 聚肌胞苷酸 | MERCK | P1530 |
| 细胞培养 | 胰蛋白酶 | Gibco | 25200072 |
| Western blot | PVDF膜 | Merck | -- |
| 化学发光底物 | Thermo | 34577 | |
| Gel Doc XR+分子成像仪 | Bio-Rad | -- | |
| DSF | SYPRO Orange染料 | Thermo | S6650 |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪 | Thermo | -- | |
| SPR | Biacore T200系统 | Cytiva | -- |
| CM5传感器芯片 | Cytiva | BR100530 | |
| LC-MS/MS | TSQ Quantum三重四极杆质谱仪 | Thermo | -- |
| UltiMate 3000 RS色谱仪 | Thermo | -- | |
| ZORBAX StableBond C18色谱柱 | Agilent | -- | |
| iTSA | timsTOF Pro 2质谱仪 | Bruker | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和报告细胞系 | Marc-145-GFP细胞系的构建和使用，确保GFP表达与PRRSV感染相关 阅读提示：Methods: Cells and viruses |
| 高通量筛选 | 化合物库（3274种）、96孔板、细胞数、MOI、孵育时间、Z'因子 阅读提示：Methods: Compounds, chemical library, and drug screening; Figure 1d-f |
| 体内药效评估 | 猪品种、年龄、体重、感染剂量、NTZ给药方案（剂量、时间、途径）、检测指标 阅读提示：Methods: In vivo antiviral effect of NTZ; Figure 3a |
| 靶点鉴定 | iTSA和CETSA的实验条件（温度、浓度），抗体浓度，细胞系 阅读提示：Methods: Cellular thermal shift assay; Figure 5 |
| 机制验证 | siRNA序列、转染条件、NTZ处理浓度、IFN-β报告基因实验条件 阅读提示：Methods: IFN-β dual-luciferase reporter assay; Figure 6 |