氢气疗法通过抑制NF-κB信号通路促进辐射性肺损伤中巨噬细胞向M2亚型极化

Hydrogen therapy promotes macrophage polarization to the M2 subtype in radiation lung injury by inhibiting the NF-κB signalling pathway.

作者信息Xue Gao, Shiying Niu, Lulu Li, Xiaoyue Zhang, Xuetao Cao, Xinhui Zhang, Wentao Pan, Meili Sun, Guoli Zhao, Xuezhen Zheng, Guohua Song, Yueying Zhang
PMID38826750
期刊Heliyon
发布时间2024-05-11
DOI10.1016/j.heliyon.2024.e30902

实验完整度

包含动物模型、肺功能检测、HE染色、免疫荧光、免疫组化和Western blot等多个实验层级,但主要依赖单一动物模型,缺乏体外或临床样本验证,且NF-κB通路验证仅限于p65磷酸化。

主要模型

C57BL/6小鼠放射性肺损伤模型

重点核对

照射剂量:20 Gy,6 MV X射线,剂量率2 Gy/min 氢气干预:4%氢气吸入,每日4小时,持续2周或5周 分组:对照组、模型组、氢气治疗组1(2周)、氢气治疗组2(5周) 检测时间:照射后第5周处死小鼠 样本量:每组10只小鼠(总40只)

摘要

背景 放疗已成为胸部肿瘤的标准治疗方法,但放疗的常见并发症是放射性肺损伤。目前,放射性肺损伤仍缺乏有效的治疗方法。 方法 构建放射性肺损伤(RILI)小鼠模型,然后用不同周期的氢气吸入治疗。进行肺功能检测以观察肺功能的变化。采用HE染色检测肺组织的病理变化。采用免疫荧光染色检测肺组织中巨噬细胞的极化。采用免疫组织化学检测肺组织中细胞因子表达的变化。采用Western Blot检测NF-κB信号通路相关蛋白的表达。 结果 肺功能检测结果显示,模型组肺功能下降,治疗组肺功能改善。HE染色显示模型组炎症反应明显,治疗组炎症反应减轻。免疫组化结果显示,模型组促炎因子的表达显著升高,治疗组促炎因子的表达显著降低,抗炎因子的表达高于模型组。免疫荧光显示,模型组M1亚型巨噬细胞表达上调,治疗组下调;治疗组M2亚型巨噬细胞表达较模型组上调。Western Blot显示,模型组P–NF-κB p65/NF-κB p65显著升高,治疗组P–NF-κB p65/NF-κB p65降低。 结论 氢气疗法通过抑制NF-κB信号通路促进巨噬细胞从M1向M2亚型极化,从而减轻放射性肺损伤的炎症反应。 关键词 关键词:氢气,放射性肺损伤,巨噬细胞极化,毒性损伤,病理机制

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
氢气疗法能否减轻放射性肺损伤,其具体机制是否涉及巨噬细胞极化和NF-κB信号通路?
核心机制
氢气通过抑制NF-κB信号通路,促进巨噬细胞从M1向M2亚型极化,减少促炎因子(IL-6、TNF-α)并增加抗炎因子(IL-10),从而减轻炎症反应。
主要证据
小鼠模型(20 Gy照射)中,氢气治疗组肺功能改善,HE染色显示炎症减轻,免疫荧光显示M2标志物CD206上调、M1标志物CD86下调,免疫组化显示IL-6和TNF-α降低、IL-10升高,Western blot显示P–NF-κB p65/NF-κB p65降低。
研究意义
研究为氢气吸入治疗放射性肺损伤提供了机制依据,可能为新抗炎药物开发提供参考。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立小鼠放射性肺损伤模型

模拟放射性肺损伤,为后续干预和检测提供基础。

对C57BL/6小鼠胸部进行单次20 Gy X射线照射,照射后5周解剖。

2

氢气干预治疗

评估不同周期的氢气吸入对放射性肺损伤的治疗效果。

照射后每日同一时间给予4%氢气吸入4小时,持续2周或5周。

3

肺功能检测

评估氢疗对肺功能的影响,验证模型及治疗效果。

使用EMKA肺功能分析系统进行无创全身体积描记(WBP),检测TVb、MVb、PIFb、PEFb和EF50。

4

肺组织病理学检测

观察肺组织病理变化,评估炎症和损伤程度。

HE染色观察肺泡隔增厚、水肿、血管充血及炎症细胞浸润。

5

巨噬细胞极化检测

验证氢疗对巨噬细胞M1/M2极化的影响。

免疫荧光染色检测M1标志物CD86(红)和M2标志物CD206(红)与F4/80(绿)共定位,并定量。

6

炎症因子表达检测

评估氢疗对促炎和抗炎因子表达的影响。

免疫组化检测IL-6、TNF-α和IL-10的表达,并进行评分。

7

NF-κB信号通路检测

验证氢疗是否抑制NF-κB信号通路的激活。

Western blot检测NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65的表达,计算比值。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证免疫效应
评估体内效果

产品清单

实验环节名称品牌货号
C57BL/6小鼠Jinan Pengyue Experimental Animal Technology Co.--
氢气发生器Jinan Haowei Experimental Instruments Co., Ltd.SPE-300
空气发生器Shanghai Bonsey Instruments Technology Co., Ltd.LCA-3
氢气检测器New CosmosXP-3140
EMKA肺功能分析系统EMKA--
光学显微镜Leica--
3D扫描仪3DHISTECH--
抗CD206抗体Biossbsm-60761R
抗CD86抗体Biossbsm-1035R
抗F4/80抗体Biossbsm-34028M
抗IL-6抗体Biossbs-0782R
抗TNF-α抗体Biossbs-10802R
抗IL-10抗体Biossbs-6761R
抗β-肌动蛋白抗体Proteintech66009-1-Ig
抗NF-κB p65抗体Proteintech66535-1-Ig
抗磷酸化NF-κB p65抗体Biossbs-3485R
山羊抗兔二抗ProteintechSA00001-2
山羊抗小鼠二抗ProteintechSA00001-1
ECL化学发光试剂Millipore--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立
小鼠品系、周龄、体重、照射剂量、剂量率、照射部位、麻醉方式
阅读提示:见Materials and Methods 2.1和2.2节
氢气干预
氢气浓度(4%)、吸入时长(4小时/天)、干预周期(2周和5周)、装置及流量
阅读提示:见Materials and Methods 2.3节
肺功能检测
检测系统(EMKA WBP)、检测指标(TVb、MVb、PIFb等)、小鼠状态
阅读提示:见Materials and Methods 2.4节和Results 3.1节
巨噬细胞极化检测
抗体克隆号及稀释比(CD206、CD86、F4/80)、切片厚度、修复条件、定量方法
阅读提示:见Materials and Methods 2.6节
炎症因子检测
抗体克隆号及稀释比(IL-6、TNF-α、IL-10)、修复条件、染色评分标准
阅读提示:见Materials and Methods 2.7节
NF-κB信号通路检测
抗体克隆号及稀释比(NF-κB p65、p-NF-κB p65)、蛋白提取方法、上样量、内参
阅读提示:见Materials and Methods 2.8节