重组系统中筛选AVPR1A与CR的异源二聚化
确定AVPR1A是否与所有人类CR形成异源二聚体。
在HEK293T细胞中共表达AVPR1A-Rluc和每种CR-YFP，通过BRET筛选和饱和BRET检测异源二聚化。
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趋化因子受体异源寡聚体调节单核细胞趋化性。
Chemokine receptor hetero-oligomers regulate monocyte chemotaxis.
实验完整度
高包含重组系统BRET筛选与饱和实验、内源性PLA检测、siRNA敲低和CRISPR/Cas9敲除功能验证、Gαi激活及趋化实验等两个以上独立证据层级。
主要模型
HEK293T重组表达系统 THP-1人单核细胞白血病细胞系 人原代单核细胞 CRISPR/Cas9基因编辑THP-1细胞系（AVPR1AKO和ADRA1BKO）
重点核对
AVPR1A与CR异源二聚化在重组系统（BRET）和内源性（PLA）中的验证 AVPR1A配体（aVP和conivaptan）对CR介导趋化性的调节作用 AVPR1A siRNA敲低对CR介导趋化性的影响 AVPR1A敲除（CRISPR/Cas9）对CR介导趋化性的影响 α1B/D-AR与AVPR1A在受体异源寡聚体中的功能相互依赖性
摘要
众所周知，压力影响免疫细胞功能。其潜在分子机制尚不清楚。我们最近报道了许多趋化因子受体（CR）与α1-肾上腺素能受体（α1-AR）异源二聚化，通过该受体调节CR。在这里，我们显示精氨酸加压素受体1A（AVPR1A）在重组系统中与所有人类CR（除趋化因子（C-X-C基序）受体（CXCR）1外）异源二聚化，并且这种异源二聚体在THP-1细胞和人单核细胞中可检测到。我们证明，无配体的AVPR1A差异调节CR伙伴介导趋化性的效能，并且AVPR1A配体破坏AVPR1A:CR异源二聚体，这增强了趋化因子（C-C基序）受体（CCR）1介导的趋化性并抑制CCR2、CCR8和CXCR4介导的趋化性。使用生物发光共振能量转移监测G蛋白激活和CRISPR/Cas9基因编辑的缺乏AVPR1A或α1B-AR的THP-1细胞，我们表明，那些与α1B/D-AR和AVPR1A共享异源二聚化倾向的CR存在于相互依赖的异源寡聚复合物中，通过该复合物控制CR介导趋化性的效能。我们的发现表明，由CR、α1B/D-AR和AVPR1A组成的异源寡聚体可能使应激激素调节免疫细胞运输。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AVPR1A是否与其他趋化因子受体形成异源二聚体，并在单核细胞中调节其功能？
- 核心机制
- CR与α1B/D-AR和AVPR1A组成异源寡聚复合物，通过构象重排影响CR激活Gαi的效能，从而调节趋化性。
- 主要证据
- BRET显示AVPR1A与除CXCR1外的所有CR异源二聚化；PLA在THP-1细胞和单核细胞中检测到AVPR1A:CR异源二聚体；AVPR1A配体及基因敲除调节CR介导的趋化性；Gαi激活实验证明依赖三种受体共表达。
- 研究意义
- 研究揭示了应激激素通过异源寡聚复合物调节固有免疫细胞运输的分子机制，为理解儿茶酚胺和加压素对白细胞运输的影响提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
内源性系统中检测AVPR1A:CR异源二聚体
验证重组系统中的发现是否适用于内源性表达系统。
使用PLA检测THP-1细胞和人类单核细胞中AVPR1A和CR的细胞表面表达及受体间邻近。
评估AVPR1A配体对CR介导趋化性的调节
测试AVPR1A配体是否调节其CR异源二聚化伙伴的功能。
在THP-1细胞和人类单核细胞中，用不同浓度的aVP或conivaptan处理，测试对趋化因子诱导的趋化性的影响。
检测AVPR1A配体对异源二聚体形成的影响
确定AVPR1A配体是否干扰AVPR1A:CR异源二聚体的形成。
用车辆、10 μM aVP或conivaptan处理THP-1细胞30分钟，通过PLA检测受体表达和受体-受体邻近。
通过siRNA敲低AVPR1A评估其功能
检验AVPR1A表达降低是否影响CR介导的趋化性及aVP的调节作用。
用NT或AVPR1A siRNA处理THP-1细胞，通过PLA验证敲低效率，并测试趋化性和aVP的影响。
CRISPR/Cas9敲除AVPR1A验证功能
通过完全敲除AVPR1A确认其对CR介导趋化性的调节作用。
生成AVPR1AKO THP-1细胞系，验证敲除效率，评估CR表达和趋化性。
评估CR:AVPR1A和CR:α1B/D-AR异源二聚体的相互依赖性
确定CR是否在由AVPR1A和α1B/D-AR组成的异源寡聚复合物中共同存在并相互依赖。
使用PLA在AVPR1AKO和ADRA1BKO细胞中检测α1B/D-AR:CR和AVPR1A:CR异源二聚体的表达变化，并测试配体对趋化性的影响。
重组系统中监测CCR1介导的Gαi激活
验证异源寡聚复合物中配体对CCR1信号转导的影响。
在HEK293T细胞中共表达CCR1、α1b-AR和/或AVPR1A，使用TRUPATH生物传感器检测Gαi激活。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证信号通路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | 抗CXCR4抗体 | Abcam | ab1670 |
| 抗AVPR1A抗体 | Bioss | bs-11598R | |
| 抗AVPR1A抗体 | LifeSpan Biosciences | LS-C126889 | |
| 抗CCR8抗体 | LifeSpan Biosciences | LS-C187704 | |
| 抗CXCR1抗体 | Invitrogen | PA5-33452 | |
| 抗CCR1抗体 | R&D Systems | MAB145 | |
| 抗CCR2抗体 | R&D Systems | MAB48607 | |
| IgG同型对照 | R&D Systems | MAB1050 | |
| IgG同型对照 | R&D Systems | MAB004 | |
| IgG同型对照 | R&D Systems | AB-108-C | |
| 趋化因子 | CCL2 | Protein Foundry | -- |
| CCL23 | Protein Foundry | -- | |
| CXCL8 | Protein Foundry | -- | |
| CXCL12 | Protein Foundry | -- | |
| 药物处理 | 酚妥拉明 | Sigma-Aldrich | -- |
| 精氨酸加压素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 考尼伐坦 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞培养 | 多聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| 基因沉默 | AVPR1A siRNA | GE Dharmacon | -- |
| 非靶向siRNA | GE Dharmacon | -- | |
| 细胞培养 | Accell转染培养基 | GE Dharmacon | -- |
| RPMI 1640培养基 | Sigma-Aldrich | -- | |
| DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胎牛血清 | Cytiva | -- | |
| 青霉素 | Invitrogen | -- | |
| 链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 单核细胞分离 | 柠檬酸钠CPT单个核细胞制备管 | Becton Dickinson | -- |
| MACS LS柱 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 生物素标记的单克隆抗人CD3、CD7、CD16、CD19、CD56、CD123和CD235a抗体 | Miltenyi Biotec | 130-117-337 | |
| 细胞培养 | Nunc六孔板 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| CRISPR/Cas9基因编辑 | LV01慢病毒质粒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 慢病毒包装混合物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| DNAzol试剂 | Invitrogen | -- | |
| Platinum Blue PCR预混液 | Invitrogen | -- | |
| T7EI检测试剂盒 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| BRET实验 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 96孔板 | Greiner Bio-One | -- | |
| 腔肠素H | -- | -- | |
| Cytation 1细胞成像多功能酶标仪 | BioTek | -- | |
| PLA | Sigma-Aldrich Duolink PLA封闭试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| Duolink洗涤缓冲液A | Sigma-Aldrich | -- | |
| Duolink洗涤缓冲液B | Sigma-Aldrich | -- | |
| Duolink原位封片剂（含DAPI） | Sigma-Aldrich | -- | |
| Keyence BZ-X710荧光显微镜 | Keyence | -- | |
| Cytospin 4离心机 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Super PAP笔 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 趋化实验 | Neuroprobe ChemoTx一次性趋化系统 | Neuroprobe | -- |
| Nunc透明平底96孔板 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Gαi激活实验 | 腔肠素400a | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组系统BRET实验 | HEK293T细胞转染的DNA量（AVPR1A-Rluc和CR-YFP的浓度）、阴性对照mGlu1R-YFP的使用、BRET测量条件（荧光和发光波长）、共elenterazine H浓度（5 μM）、实验重复次数。 阅读提示：Materials and Methods：BRET screening and saturation BRET；Figure 1 legend |
| 内源性PLA检测 | 细胞数量（20,000个/漏斗）、固定（4%多聚甲醛15分钟）、封闭（4°C过夜）、一抗浓度（1 μg/ml）、PLA探针孵育时间（60分钟）、连接和扩增时间（30分钟和105分钟）、显微镜设置（60×油镜、z-stack厚度0.5μm）、分析的视野数（10个）。 阅读提示：Materials and Methods：PLA；Figure 2 legend |
| 趋化实验 | Boyden小室规格（孔径8μm，30 μl底部体积，25 μl细胞悬液）、细胞密度（200 cells/μl）、趋化因子浓度（CCL2 10 nM、CCL23 0.1 nM、CXCL8 10 nM、CXCL12 100 nM）、迁移时间（3小时）、细胞计数方法（Cytation 1成像）。 阅读提示：Materials and Methods：Chemotaxis assays；Figures 3-5 legends |
| siRNA敲低 | siRNA浓度（1 μM）、处理时间（3天）、转染培养基（Accell）、细胞处理后的恢复时间（1天）。 阅读提示：Materials and Methods：Gene silencing by RNA interference；Figure 7 legend |
| CRISPR/Cas9基因敲除 | sgRNA靶向序列（ACAGCCGACCGCTACATCG）、慢病毒生产（LV01质粒和包装混合物）、转导和选择（嘌呤霉素1 μg/ml）、克隆筛选（96孔板单细胞种植）、T7EI检测和测序。 阅读提示：Materials and Methods：CRISPR/Cas9 gene editing；Figure 8 legend |
| Gαi激活实验 | TRUPATH传感器质粒量（0.2 μg各）、CCR1质粒量（0.1 μg）、共表达α1b-AR和/或AVPR1A的量、共elenterazine 400a浓度（5 μM）、配体孵育时间（3分钟）、BRET测量波长（410和515 nm）。 阅读提示：Materials and Methods：Gαi activation assays；Figure 11 legend |