融合蛋白的构建、表达与纯化
构建抗IL-17A-sST2双功能融合蛋白并评估其纯度。
将sST2通过(Gly4Ser)3连接子融合到抗IL-17A抗体重链C端，构建质粒，转染293F细胞表达，用protein A亲和层析纯化。
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一种新型双功能融合蛋白（抗IL-17A-sST2）通过调节TLR4/MyD88通路和NLRP3炎症小体活化来保护急性肝衰竭
A Novel Bifunctional Fusion Protein (Anti-IL-17A-sST2) Protects against Acute Liver Failure, Modulating the TLR4/MyD88 Pathway and NLRP3 Inflammasome Activation.
实验完整度
高包含体外细胞实验、蛋白特性分析、LPS/D-GalN诱导的小鼠ALF模型，以及体内机制验证（TLR4/MyD88通路和NLRP3炎症小体）。
主要模型
LPS/D-GalN诱导的C57BL/6J小鼠急性肝衰竭模型 RAW 264.7巨噬细胞 C3H/10T1/2细胞
重点核对
LPS/D-GalN剂量：LPS 30 µg/kg，D-GalN 600 mg/kg，腹腔注射 蛋白给药剂量：抗IL-17A-sST2 12 mg/kg（等摩尔55 nmol/kg） 给药时间：LPS/D-GalN注射前24小时腹腔注射蛋白 取材时间：LPS/D-GalN注射后4.5小时 检测指标：血清AST、ALT、TNF-α、IL-6，肝组织TLR4、MyD88、NLRP3、caspase-1、IL-1β
摘要
急性肝衰竭（ALF）是一种严重的炎症性疾病，具有高死亡率，对人类健康构成重大威胁。IL-33/ST2信号是脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞相关炎症反应中的关键调节因子。IL-17A信号通路在LPS刺激下促进趋化因子和炎性细胞因子的释放，募集中性粒细胞和T细胞，从而促进炎症反应。本研究探讨了中和IL-17A信号和调节IL-33/ST2信号在ALF中的潜在治疗益处。构建了一种新型双功能融合蛋白抗IL-17A-sST2，其显示出高纯度和生物活性。给予抗IL-17A-sST2在ALF小鼠中产生了显著的抗炎益处，改善了肝细胞坏死和间质充血，并降低了TNF-α和IL-6。此外，注射抗IL-17A-sST2下调了TLR4和NLRP3以及MyD88、caspase-1和IL-1β等重要分子的表达。结果表明，抗IL-17A-sST2通过调节TLR4/MyD88通路和抑制NLRP3炎症小体，减少了炎性因子的分泌，减轻了炎症反应，并保护了肝功能，为ALF提供了一种新的治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 同时阻断IL-17A和IL-33/ST2信号是否能通过调节TLR4/MyD88通路和NLRP3炎症小体活化来减轻LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭？
- 核心机制
- 抗IL-17A-sST2通过下调TLR4/MyD88通路并抑制NLRP3炎症小体活化，减少促炎细胞因子分泌，从而减轻肝脏炎症和损伤。
- 主要证据
- 在LPS/D-GalN诱导的ALF小鼠中，抗IL-17A-sST2处理后血清AST、ALT、TNF-α、IL-6水平显著降低，肝脏组织病理改善，TLR4、MyD88、NLRP3、cleaved caspase-1及IL-1β表达下调（通过IHC、Western blot、RT-qPCR验证）。
- 研究意义
- 该研究提供了一种新型双功能融合蛋白作为治疗ALF的潜在策略，同时调节IL-33/ST2和IL-17A通路，可能为ALF治疗提供新的思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
融合蛋白的理化特性分析
评估融合蛋白的热稳定性和结合亲和力。
通过SEC-HPLC评估纯度；通过UNCLE测定Tm和Tagg；通过SPR测定与IL-17A和IL-33的结合亲和力。
体外生物活性验证
验证融合蛋白是否保留抗IL-17A和sST2的生物学功能。
通过检测LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6释放来评估sST2活性；通过检测IL-17A诱导的C3H10T1/2细胞IL-6分泌来评估抗IL-17A活性。
体内药效评估
评估抗IL-17A-sST2对LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭小鼠的保护作用。
LPS/D-GalN注射前24小时腹腔注射不同蛋白，4.5小时后取血和肝脏，检测肝功能指标、组织病理和炎症因子。
机制研究
探究抗IL-17A-sST2保护肝功能的分子机制。
检测肝组织中TLR4、MyD88、NLRP3、caspase-1、IL-1β的表达水平。
初步安全性评估
评估抗IL-17A-sST2是否对主要器官产生毒性。
对两种剂量的融合蛋白处理的小鼠主要器官进行H&E染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | OPM-293 CD05培养基 | Opmbiosciences | 81075 |
| 动物实验 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L4391 |
| D-半乳糖胺 | Beyotime Biotechnology | ST1213 | |
| 载体构建 | PCR预混液 | YEASEN | 10136ES |
| ClonExpress II 一步克隆试剂盒 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | C115 | |
| EcoRI限制性内切酶 | TaKaRa | 1040 | |
| BamHI限制性内切酶 | TaKaRa | 1010 | |
| 蛋白纯化 | 蛋白A亲和层析柱 | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| 体外活性测定 | IL-17A抗原 | Sino Biological | -- |
| 小鼠IL-33 | Elabscience Biotechnology | PDEM100058 | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Multi Sciences | EK206 | |
| 生化分析 | ALT检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering | -- |
| AST检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Yeasen | -- |
| 抗MyD88抗体 | Bioss | bs-1047R | |
| 抗caspase-1抗体 | Abcam | ab179515 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118S | |
| 二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 电化学发光试剂 | Meilunbio | -- | |
| RT-qPCR | HiScript II Q RT SuperMix 逆转录试剂 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | R333 |
| ChamQ SYBR qPCR 预混液 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | Q711 | |
| NanoDrop微量分光光度计 | -- | -- | |
| QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 组织学 | SlideView VS200显微镜 | Olympus | -- |
| 免疫组化 | 抗TLR4抗体 | Servicebio | GB11519 |
| 抗NLRP3抗体 | Abways Technology | CY5651 | |
| 数据分析 | Image J软件 | -- | -- |
| Graph Pad Prism 9.0软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 雄性C57BL/6J小鼠鼠龄、体重、来源；LPS和D-GalN的剂量及给药途径 阅读提示：见2.2 Animals |
| 蛋白给药方案 | 蛋白种类、剂量（等摩尔）、给药时间（LPS/D-GalN前24h）、给药途径（腹腔注射） 阅读提示：见2.2 Animals |
| 组织取材 | 取材时间点（LPS/D-GalN后4.5h）、样本类型（血液、肝脏、脾脏） 阅读提示：见2.2 Animals |
| 体外活性测定 | 细胞系、处理浓度、孵育时间、检测指标（IL-6） 阅读提示：见2.7-2.8 和 Figure 2 |
| 分子机制检测 | IHC抗体稀释度、Western blot上样量、RT-qPCR引物序列 阅读提示：见2.11-2.14 和 Figure 5、6 |