临床样本与细胞系中KIF15表达检测
评估KIF15在脊索瘤组织及细胞系中的表达水平。
利用IHC检测不同病理分期脊索瘤组织中KIF15蛋白表达；通过qRT-PCR和Western blot检测HEK-293T、MUG-Chor1和U-CH1细胞中KIF15 mRNA和蛋白水平。
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KIF15通过激活PI3K-AKT信号通路促进脊索瘤的发生发展
KIF15 promotes the development and progression of chordoma via activating PI3K-AKT signalling pathway.
实验完整度
高包含细胞系体外功能实验（增殖、迁移、凋亡、周期）、体内裸鼠异种移植模型、IHC和Western blot蛋白检测，以及通路激活剂/抑制剂回补实验，涵盖多层级功能与机制验证。
主要模型
MUG-Chor1细胞系 U-CH1细胞系 HEK-293T细胞 BALB/c裸鼠异种移植模型 人脊索瘤组织芯片
重点核对
细胞系：MUG-Chor1和U-CH1，HEK-293T作为对照 敲低序列：shKIF15-1、shKIF15-2、shKIF15-3，转染效率>80% AKT激活剂浓度：10 μM，处理时间：24小时 PI3K抑制剂LY294002浓度：40 μM，处理时间：24小时 裸鼠模型：MUG-Chor1细胞4×10^6皮下注射，每组10只
摘要
目的：尽管KIF15在多种人类癌症中发挥作用，但其在脊索瘤中的表达和功能意义仍未探索。主要方法：通过免疫组织化学（IHC）染色和Western blot评估KIF15蛋白水平。使用MTT和CCK8实验量化细胞增殖，使用划痕愈合和Transwell实验检测细胞迁移。此外，利用流式细胞术分析评估细胞凋亡和细胞周期。此外，使用小鼠异种移植模型进行了体内实验。主要发现：我们的研究显示，与II期脊索瘤组织相比，III期脊索瘤组织中KIF15的表达显著升高。敲低KIF15显著抑制细胞增殖和迁移，同时增强细胞凋亡和细胞周期阻滞。体内研究进一步证实了KIF15敲低对脊索瘤肿瘤生长的抑制作用。在机制方面，我们确定了KIF15介导的PI3K-AKT信号通路参与脊索瘤。值得注意的是，AKT激活剂的加入部分逆转了KIF15缺失对脊索瘤的抗肿瘤作用。意义：KIF15通过激活PI3K-AKT信号通路促进脊索瘤的发生发展。因此，靶向KIF15可能是治疗脊索瘤的一种有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KIF15在脊索瘤中的表达及其对脊索瘤发生发展的作用机制是什么？
- 核心机制
- KIF15通过激活PI3K-AKT信号通路促进脊索瘤的发生发展。
- 主要证据
- 在细胞系中敲低KIF15抑制增殖、迁移，促进凋亡和周期阻滞；体内裸鼠移植瘤模型证实敲低KIF15抑制肿瘤生长；通路激活剂和抑制剂实验证实KIF15通过PI3K-AKT通路发挥作用。
- 研究意义
- 靶向KIF15可能是治疗脊索瘤的一种有前景的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
KIF15敲低细胞模型构建
建立KIF15敲低的脊索瘤细胞模型以研究其功能。
设计并合成针对KIF15的shRNA序列，构建BR-V-108载体，通过慢病毒转染MUG-Chor1和U-CH1细胞，并通过Western blot和荧光显微镜验证敲低效率。
体外细胞功能验证
验证KIF15敲低对脊索瘤细胞增殖、迁移、凋亡和细胞周期的影响。
利用MTT和CCK8检测细胞增殖；划痕愈合和Transwell实验检测迁移；流式细胞术检测凋亡和细胞周期。
体内裸鼠移植瘤模型验证
验证KIF15敲低在体内对肿瘤生长的影响。
将shCtrl或shKIF15转染的MUG-Chor1细胞皮下注射到裸鼠，监测肿瘤生长，并通过生物发光成像、肿瘤体积和重量评估。
机制验证：KIF15调控PI3K-AKT通路
探究KIF15调控脊索瘤发生发展的潜在分子机制。
利用PrimeView人类基因表达芯片进行KEGG通路富集分析，鉴定PI3K-AKT通路；使用AKT激活剂和PI3K抑制剂处理KIF15敲低或过表达的细胞，检测通路蛋白变化及细胞表型恢复情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 免疫组织化学 | EDTA抗原修复液 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| KIF15抗体 | Fine Test | -- | |
| Ki-67抗体 | Abcam | -- | |
| 山羊抗兔IgG H&L（HRP） | Abcam | -- | |
| 中性树脂 | China National Pharmaceutical Group Co., Ltd. | -- | |
| 细胞转染 | BR-V-108载体 | Shanghai Yibeirui Biomedical Science and Technology Co., Ltd. | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| TOP 10感受态细胞 | TIANGEN | CB104-03 | |
| RNA提取与qRT-PCR | TRIzol试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| M-MLV反转录试剂盒 | Promega | -- | |
| SYBR Green Master Mix试剂盒 | Vazyme | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| KIF15抗体 | Fine Test | FNab04551 | |
| AKT抗体 | Proteintech | 10176-2-AP | |
| 磷酸化AKT抗体 | Proteintech | 66444-1-Ig | |
| PI3K抗体 | Proteintech | 67071-1-Ig | |
| 磷酸化PI3K抗体 | Bioss | bs-3332R | |
| GAPDH抗体 | Bioworld | AP0063 | |
| 山羊抗兔二抗 | Beyotime | A0208 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | Beyotime | A0216 | |
| ECL Plus化学发光检测系统 | -- | -- | |
| 细胞增殖检测 | MTT试剂 | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| CCK-8试剂 | -- | -- | |
| 药物处理 | AKT激活剂 | -- | -- |
| LY294002 | -- | -- | |
| GW406108X | -- | -- | |
| 流式凋亡检测 | Annexin V-APC | eBioscience | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| FACSCalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 动物实验 | IVIS Spectrum小动物活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 基因表达芯片 | Nanodrop 2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| Agilent RNA 6000 Nano试剂盒 | Agilent | -- | |
| Affymetrix GeneChip PrimeView芯片 | Affymetrix | -- | |
| Affymetrix Scanner 3000扫描仪 | Affymetrix | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系与培养 | 细胞系来源（ATCC）、培养基（RPMI-1640）、血清浓度（10% FBS）、抗生素使用（是否添加青霉素/链霉素）、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and methods, 2.2 Cell lines and cell culture |
| KIF15敲低 | shRNA序列（shKIF15-1、-2、-3）、载体（BR-V-108）、转染试剂（Lipofectamine 3000）、转染效率（>80%） 阅读提示：Materials and methods, 2.4 Overexpression plasmids and lentivirus RNAi construction and transfection |
| 细胞增殖检测 | 检测方法（MTT、CCK8）、细胞密度、孵育时间、检测波长（490 nm、450 nm）、重复次数（3次） 阅读提示：Materials and methods, 2.7 Cell proliferation detection |
| 细胞迁移检测 | 划痕实验细胞密度（3.5×10^4/孔）、血清浓度（0.5% FBS）、时间点（24、48 h）；Transwell上室密度（1×10^5/mL）、下室FBS浓度（30%） 阅读提示：Materials and methods, 2.8 Wound healing assay and 2.9 Transwell assay |
| 凋亡与周期检测 | 凋亡染色（Annexin V-APC/PI）、周期染色（PI）、离心条件（1300 g、1200 g）、仪器（FACSCalibur） 阅读提示：Materials and methods, 2.10 Detection of cell apoptosis and cell cycle by FACS |
| 体内模型 | 鼠种（BALB/c nude，雄性，4周龄）、每组数量（10只）、注射细胞数（4×10^6）、监测时长（18天） 阅读提示：Materials and methods, 2.11 Construction of nude mouse tumour formation model |