血浆样本制备
获得无血小板血浆用于后续EV分离
血液收集于含柠檬酸钠的试管中，通过离心去除细胞和血小板。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
基于电荷的人血浆细胞外囊泡分离
Charge-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Human Plasma.
实验完整度
中研究包含方法开发、性能优化（pH梯度）、与常规方法对比（UC、PP）及电镜和NTA验证，但缺少体内或临床样本验证。
主要模型
人血浆样本 PC-9细胞系 THP-1细胞系
重点核对
缓冲液pH为7.4时进行电荷分离 使用带正电的阴离子交换剂Q Sepharose Fast Flow 血浆样本：0.5 mL，与等体积珠子室温孵育10分钟 对比方法：超速离心、聚合物沉淀 纯度分析以CD63为主要标记
摘要
细胞外囊泡（EVs）因其在疾病诊断和管理中的潜在应用而受到广泛关注。然而，主要从血液样本中分离EVs的过程仍不理想，这主要归因于可溶性蛋白质和脂蛋白的丰富性，它们通常与EVs一起被传统分离方法的最终产物所分离。因此，我们设计了一种基于电荷的单步EV分离方法，利用带正电荷的微珠通过静电相互作用选择性去除人血浆中带负电荷的主要杂质。通过仔细控制缓冲液pH，我们成功地从不需要的血浆成分中收集到EVs，其纯度和产率均优于传统的EV收集方法。此外，该过程快速，整个EV分离仅需约20分钟。基于电荷的分离最终可有益于基于EV的液体活检领域，用于多种疾病的早期诊断。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种快速、单步的基于电荷的EV分离方法，从人血浆中高效纯化EVs，以克服传统方法低纯度和耗时的问题。
- 核心机制
- 利用EVs与血浆主要杂质（如脂蛋白和白蛋白）表面电荷的差异，通过带正电微珠选择性吸附带负电的杂质，而保留带负电较弱的EV亚群。
- 主要证据
- 通过Western blot检测CD63纯度，显示pH 7.4时纯度最高；NTA和TEM确认EVs的粒径和形态；与UC和PP相比，CD63纯度提高2.5倍和4倍，产量提高2-5倍。
- 研究意义
- 该电荷分离方法有望成为EV分离的新平台，加速EV研究的临床转化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
电荷分离方法开发与pH优化
确定最佳缓冲液pH，以最大化EV纯度和产量
将血浆与带正电的Q Sepharose Fast Flow珠子在不同pH缓冲液中孵育，收集上清液并通过Western blot分析EV标志物和杂质。
EV表征
确认分离颗粒为EVs并评估其特性
对pH 7.4分离的上清液进行NTA和TEM分析，确定粒径分布和形态。
与常规方法比较
评估新方法与现有方法在纯度和产量上的优劣
将同一患者血浆分为三份，分别用电荷法、聚合物沉淀法和超速离心法分离EVs，通过Western blot和NTA比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 电荷分离 | Q Sepharose Fast Flow 阴离子交换剂 | Cytiva | -- |
| 血浆制备 | 柠檬酸钠采血管 | BD | -- |
| 超速离心 | Beckman SW60 转子 | Beckman Coulter | -- |
| 聚合物沉淀 | 总外泌体分离试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 尺寸排阻色谱 | Sepharose CL-2B 树脂 | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| 缓冲液交换 | Zeba 离心脱盐柱 | Thermo Scientific | -- |
| 蛋白质定量 | BCA 蛋白定量试剂盒 | Thermo Fischer | -- |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | -- | -- |
| 丽春红S溶液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Western blot（抗体） | 抗ApoB-100抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-25542 |
| 抗ApoA-1抗体 | Abcam | ab33470 | |
| 抗CD9抗体 | Invitrogen | PA5-85955 | |
| 抗CD63抗体 | Bioss | bs-1523R | |
| 抗TSG101抗体 | Bioss | bs-1365R | |
| 抗钙联蛋白抗体 | Bioss | bs-1693R | |
| 抗白蛋白抗体 | Bioss | bs-0945R | |
| Western blot（二抗） | HRP标记的抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7074S |
| HRP标记的抗鼠二抗 | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Western blot（ECL） | Clarity Western ECL 底物 | Bio-Rad | -- |
| NTA | Nanosight 纳米颗粒分析仪 | Malvern Instruments | -- |
| DLS | Zetasizer Nano ZS90 粒度仪 | Malvern Instrument | -- |
| DLS（标准品） | 低密度脂蛋白 | Fitzgerald | -- |
| 高密度脂蛋白 | Fitzgerald | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| pH优化 | 缓冲液pH（5.4-9.4）、缓冲液浓度10 mM、血浆与珠子体积比、孵育时间与温度 阅读提示：Materials and Methods 2.7 及 Figure 2 |
| 电荷分离 | 使用Q Sepharose Fast Flow珠子，pH 7.4，血浆与珠子各0.5 mL，室温10分钟 阅读提示：Materials and Methods 2.7 及 Results 部分 |
| EV表征 | NTA稀释倍数、TEM染色条件 阅读提示：Materials and Methods 2.9 和 2.10 |
| 对比实验 | 同一患者血浆样本，超速离心条件（100,000g，1小时）、聚合物沉淀条件（试剂用量，室温10分钟） 阅读提示：Materials and Methods 2.4 和 2.5 及 Figure 3 |