建立铁过载小鼠模型并评估表型
研究铁过载对小鼠十二指肠形态、上皮功能及氧化应激的影响。
通过腹腔注射铁葡聚糖建立铁过载模型，检测体重、饲料摄入、肠道通透性、H&E染色、TEM观察微绒毛、ROS相关蛋白表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
系统性铁过载应激下肠干细胞向杯状细胞分化与Notch信号通路抑制及铁死亡相关
Differentiation of intestinal stem cells toward goblet cells under systemic iron overload stress are associated with inhibition of Notch signaling pathway and ferroptosis.
实验完整度
高包含体内小鼠模型、体外类肠道模型及铁死亡小鼠模型，涵盖形态学、功能、分子表达及机制验证。
主要模型
小鼠铁过载模型 小鼠类肠道模型 铁死亡小鼠模型
重点核对
铁过载小鼠模型：120 mg/kg体重的铁葡聚糖腹腔注射，每两周一次，持续12周 类肠道铁过载模型：3 mM或10 mM柠檬酸铁铵处理24小时 铁死亡小鼠模型：25 mg/kg体重的erastin腹腔注射，每12小时一次，持续2天 Notch信号通路相关蛋白（Notch1, NICD, RBP-Jκ, Atoh1）的表达 铁死亡相关指标（Ptgs2 mRNA, MDA, GSH, SLC7A11, GPX4）
摘要
铁过载可导致氧化应激和肠道损伤，并且经常发生在输血和补铁过程中。然而，铁过载如何影响肠黏膜仍不清楚。本研究旨在探讨铁过载对肠干细胞（ISCs）增殖和分化的影响。通过腹腔注射120 mg/kg体重的铁葡聚糖，每两周一次，持续12周，建立铁过载小鼠模型；通过用3 mM或10 mM的柠檬酸铁铵处理24小时，建立铁过载类肠道模型。我们发现铁过载导致肠道形态损伤，绒毛高度/隐窝深度比降低64%，并且十二指肠微绒毛损伤。铁过载通过抑制十二指肠中营养转运蛋白的表达和增强分泌因子的表达来介导上皮功能。同时，铁过载抑制ISCs的增殖，并通过抑制Notch信号通路，在体内和类肠道中调节其向分泌性成熟细胞（如杯状细胞）的分化。此外，铁过载导致肠道上皮细胞发生氧化应激和铁死亡。另外，铁死亡也能抑制Notch信号通路，并影响ISCs的增殖和分化。这些发现揭示了铁过载对ISCs增殖和分化的调节作用，为铁过载影响肠道健康的内部机制提供了新的见解，并为铁营养调控的科学应用提供了重要的理论基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 铁过载如何影响肠干细胞的增殖和分化？
- 核心机制
- 铁过载通过抑制Notch信号通路，并诱导铁死亡，从而抑制ISCs增殖并促使其向杯状细胞分化。
- 主要证据
- 铁过载小鼠和类肠道模型中Notch信号通路相关蛋白表达降低，同时铁死亡标志物增加；铁死亡小鼠模型中也观察到Notch通路抑制及ISCs增殖和分化改变。
- 研究意义
- 揭示了铁过载影响肠道健康的新机制，为铁营养调控的科学应用提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测十二指肠上皮功能相关分子表达
评估铁过载对营养吸收和分泌功能的影响。
通过Western blot和qPCR检测营养转运蛋白（BCAT2, SLC7A5, FABP2, SGLT1, GLUT2）及分泌因子（CCL9, IL-13, TFF3等）的表达。
检测ISCs增殖和分化标志物
观察铁过载对ISCs增殖和分化方向的影响。
通过免疫荧光、AB-PAS染色和qPCR检测ISCs标志物（Lgr5, OLFM4），增殖标志物（Ki67）及各分化细胞标志物（ChrA, Lyz, Muc2, Vil1）。
建立铁过载类肠道模型并验证表型
在体外验证铁过载对ISCs增殖和分化的影响。
分离小鼠肠隐窝培养类肠道，用FAC处理后检测类肠道形态、Lgr5阳性细胞、Ki67阳性细胞及相关标志物表达。
检测铁过载诱导的铁死亡
确认铁过载是否在十二指肠和类肠道中诱导铁死亡。
检测Ptgs2 mRNA表达、MDA和GSH含量、铁死亡相关蛋白（SLC7A11, GPX4）及线粒体形态。
检测Notch信号通路
探究铁过载是否抑制Notch信号通路。
通过qPCR和Western blot检测Notch配体（Dll1, Dll4）、受体（Notch1）、下游分子（RBP-Jκ, Hes1）及负调控因子Atoh1的表达，并用IF检测Notch1和NICD。
铁死亡小鼠模型验证机制
验证铁死亡是否抑制Notch信号通路并影响ISCs命运。
用erastin诱导铁死亡小鼠模型，检测OLFM4、Ki67、杯状细胞数量，以及Notch相关基因和NICD蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 铁葡聚糖 | Pharmacosmos A/S | uniferon® |
| 类肠道培养 | 柠檬酸铁铵 | Sigma-Aldrich | -- |
| 铁死亡模型诱导 | erastin | Selleck chemicals | -- |
| 肠道通透性测定 | FITC-葡聚糖 | Sigma | -- |
| 细胞培养 | IntestiCult™ 类器官生长培养基 | Stemcell technology | -- |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 免疫荧光 | 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 |
| Western blot | 抗Atoh1抗体 | Proteintech | 21215-1-AP |
| 抗BCAT2抗体 | HuaBio | EM1707-98 | |
| 抗Claudin1抗体 | HuaBio | ER1906-37 | |
| 抗ChrA抗体 | Abcam | ab15160 | |
| 抗COX-2抗体 | HuaBio | ET1610-23 | |
| 抗DMT1抗体 | Abcam | ab55735 | |
| 抗FABP2抗体 | HuaBio | ER1911-53 | |
| 抗Fpn1抗体 | Bioss | bs-4906R | |
| 抗FtH抗体 | Bioss | bs-5907R | |
| 抗GLUT2抗体 | Bioss | bs-0351R | |
| 抗GPX4抗体 | HuaBio | ER1803-15 | |
| 抗HO-1抗体 | Bioss | bs-2075R | |
| 抗Keap1抗体 | Abcam | ab119403 | |
| 抗Lf抗体 | Abcam | ab166803 | |
| 抗Lgr5抗体 | Abcam | ab75732 | |
| 抗Lyz抗体 | Abcam | ab108508 | |
| 抗Muc2抗体 | Santa Cruz | sc-515032 | |
| 抗NICD抗体 | Cell Signaling Technology | 4147 | |
| 抗Nrf2抗体 | Abcam | ab62352 | |
| 抗Notch1抗体 | HuaBio | D6F11 | |
| 抗Occludin抗体 | HuaBio | R1510-33 | |
| 免疫荧光 | 抗OLFM4抗体 | Cell Signaling Technology | 39141 |
| Western blot | 抗RBP-Jk抗体 | Cell Signaling Technology | 5313 |
| 抗SGLT1抗体 | HuaBio | ER1916-51 | |
| 抗SLC7A5抗体 | HuaBio | ER1916-84 | |
| 抗SLC7A11抗体 | HuaBio | ER1905-55 | |
| 抗TfR抗体 | Bioss | bs-0988R | |
| 抗Vil1抗体 | Proteintech | 16488-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488山羊抗兔 | Abcam | ab150077 |
| Alexa Fluor 594山羊抗兔 | Abcam | ab150080 | |
| Western blot | ECL Plus检测设备 | Clinx Science Instruments | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | KeyGEN BioTECH | -- |
| 组织裂解 | 裂解缓冲液 | KeyGEN BioTECH | -- |
| qPCR | Hieff UNICON® qPCR SYBR Green预混液 | YEASEN | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Simgen | -- |
| 血清铁检测 | 血清铁测定试剂盒 | Jiancheng | -- |
| 总铁结合能力测定试剂盒 | Jiancheng | -- | |
| 脂质过氧化检测 | MDA检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| 抗氧化检测 | GSH检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| 显微镜 | 酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| qPCR | ABI 7500 StepOne实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| 显微镜 | 奥林巴斯NP-26 | Olympus | -- |
| 荧光酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 电子显微镜 | SU-8010扫描电子显微镜 | Hitachi | -- |
| H-7650透射电子显微镜 | Hitachi | -- | |
| 显微镜 | 共聚焦荧光显微镜 | Zeiss | -- |
| 其他 | DAPI | Sangon Biotech | 1: 5000 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 铁过载小鼠模型 | 铁葡聚糖剂量、注射频率（每两周一次）、持续时间（12周）、对照组处理（生理盐水）、动物品系、性别、年龄、饲养环境。 阅读提示：Materials and methods - Animals, 2.1；Figure legends 1 |
| 铁过载类肠道模型 | 类肠道培养条件（Matrigel、生长培养基、传代周期）、FAC浓度（3 mM和10 mM）、处理时间（24小时）、对照组处理（PBS）。 阅读提示：Materials and methods - Isolation of intestinal crypts and enteroids culture, 2.12；Figure legends 5 |
| 铁死亡小鼠模型 | erastin剂量（25 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、给药间隔（12小时）、持续时间（2天）、对照组（生理盐水）。 阅读提示：Materials and methods - Animals, 2.1；Figure legends 8 |
| 免疫荧光和Western blot | 抗体稀释度、抗原修复、封闭条件、二抗浓度、ECL检测条件。 阅读提示：Materials and methods - Immunofluorescence, 2.10；Western blot, 2.5；Table 2 |
| qPCR | 引物序列（Table 1）、RNA提取方法、逆转录条件、PCR条件（SYBR Green Master Mix）、内参基因（β-actin）、相对定量方法（2^-ΔΔCT）。 阅读提示：Materials and methods - Quantitative real-time PCR, 2.3；Table 1 |