单克隆抗体的纯化
从杂交瘤上清中纯化139H2 IgG，为后续测序做准备。
使用Protein G亲和层析纯化139H2，并用PBS透析。
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基于质谱的从头测序对抗MUC1抗体139H2进行逆向工程
Reverse-engineering the anti-MUC1 antibody 139H2 by mass spectrometry-based de novo sequencing.
实验完整度
高包含质谱从头测序、重组表达与功能验证（Western blot、免疫荧光）、SPR亲和力测定及晶体结构解析等多个独立证据层级，明确包含功能验证和机制验证。
主要模型
HT29-MTX细胞系 HT29-MTX ΔMUC1细胞系 HEK293细胞表达体系 139H2 Fab与APDTRPAPG肽复合物晶体
重点核对
用于从头测序的四种蛋白酶（trypsin, chymotrypsin, α-lytic protease, thermolysin） 重组139H2 IgG在HEK293细胞中的共转染表达 Western blot验证使用HT29-MTX和HT29-MTX ΔMUC1细胞系 SPR结合实验使用的MUC1肽序列biotin-GGS-APDTRPAPG 晶体结构分辨率2.5 Å
摘要
粘蛋白1（MUC1）是一种跨膜粘蛋白，在黏膜表面的上皮细胞顶端表面表达。MUC1具有抵抗细菌入侵的屏障功能，并因其在腺癌中的异常表达和糖基化而闻名。MUC1的胞外域含有20个氨基酸的串联重复序列（VNTR），这些重复序列被高度O-连接糖基化。针对MUC1 VNTR的单克隆抗体是强大的研究工具，可用于诊断和治疗表达MUC1的癌症。在这里，我们报道了基于质谱的杂交瘤来源的139H2 IgG的直接测序，从而实现了功能性重组单克隆抗体的逆向工程。我们解析了139H2 Fab片段与MUC1表位复合物的晶体结构，揭示了139H2结合MUC1特异性的分子基础及其对VNTR O-糖基化的耐受性。可用的139H2序列将促进MUC1相关诊断、靶向和治疗策略的进一步发展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过质谱从头测序确定抗MUC1抗体139H2的完整序列，并解析其与MUC1表位结合的分子机制？
- 核心机制
- 139H2通过其重链和轻链的CDR与APDTRPAPG表位结合，关键残基D3和R5通过盐桥相互作用，T4侧链向外突出，避免与O-糖链冲突，从而实现对O-糖基化的耐受性。
- 主要证据
- 通过质谱从头测序获得抗体序列，重组表达后经Western blot和免疫荧光验证功能，SPR测定亲和力，晶体结构解析表位相互作用。
- 研究意义
- 该抗体可用于MUC1相关诊断、靶向和治疗策略的开发，并促进可重复的科学研究的开放性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
质谱从头测序
测定139H2的全长序列。
纯化的IgG用多种蛋白酶消化，LC-MS/MS分析，利用PEAKS和Stitch软件从头测序并组装序列。
重组表达和验证
验证测序得到的序列是否正确，并产生功能性抗体。
将测序序列密码子优化后克隆到表达载体，在HEK293细胞中共表达IgG和Fab，通过HisTrap纯化，并与杂交瘤来源的抗体在Western blot和免疫荧光中比较。
表位作图和亲和力测定
测定139H2与MUC1表位肽的结合亲和力，并验证其结合特性。
使用SPR测定IgG和Fab与生物素化多肽的结合；通过晶体结构解析表位相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体纯化 | 纯化方法：Protein G亲和层析；洗脱条件：0.2 mM甘氨酸pH 2.5；中和：1 M Tris-HCl pH 8；透析：PBS 阅读提示：Materials and Methods: Purification of 139H2 from the hybridoma culture supernatant |
| 质谱测序 | 蛋白酶组合：trypsin, chymotrypsin, α-lytic protease, thermolysin；碎裂方式：sHCD和EThcD；质谱仪：Orbitrap Fusion；色谱柱：Poroshell 120 EC-C18 阅读提示：Materials and Methods: Bottom-up proteomics—in-solution digestion, in-gel digestion, LC-MS/MS |
| 重组表达 | 表达细胞：HEK293细胞；表达载体：pRK5；共转染DNA比例：1:1 (IgG) 或1:1 (Fab)；纯化：HisTrap Excel柱；SEC：Superdex 200 Increase 10/300 GL 阅读提示：Materials and Methods: Cloning and expression of recombinant 139H2 IgG and Fab |
| 功能验证 | 细胞系：HT29-MTX和HT29-MTX ΔMUC1；Western blot条件：40 μg蛋白/孔，转移至PVDF膜；免疫荧光：一抗稀释1:100，固定4% PFA 阅读提示：Materials and Methods: Western blot, Confocal microscopy; Figure 3 legend |
| SPR分析 | 固定化肽：biotin-GGS-APDTRPAPG；SPR仪器：IBIS-MX96；IgG浓度范围：10.0 μM至~0.02 μM；Fab浓度范围：7.88 μM至~0.03 μM；结合/解离时间：IgG 30/10 min，Fab 6/4 min 阅读提示：Materials and Methods: SPR; Figure S3 legend |
| 晶体结构解析 | Fab与肽比例：1:2.5；结晶条件：0.2 M NaCl, 0.1 M sodium-phosphocitrate, 20% PEG 8000；分辨率：2.5 Å；数据处理：xia2.multiplex, AIMLESS 阅读提示：Materials and Methods: Crystallization and data collection, Structure determination and refinement |