SMC特异性PDGFRB敲除小鼠模型建立与验证
验证SMC中PDGFRB信号对病变和纤维帽中SMC积累的必要性。
将Myh11-CreERT2/ROSA26-eYFP Apoe−/−小鼠与PdgfrbFL/FL杂交，他莫昔芬诱导后获得PdgfrbSMC-Δ/Δ和WT/WT小鼠，通过PCR和免疫荧光验证敲除效率。
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- 移动端
多种细胞类型通过PDGFRβ和生物能量机制参与动脉粥样硬化病变纤维帽的形成
Multiple cell types contribute to the atherosclerotic lesion fibrous cap by PDGFRβ and bioenergetic mechanisms
实验完整度
高包含体内SMC和EC条件性基因敲除小鼠模型、谱系示踪、scRNA-seq和bulk RNA-seq、体外SMC和HUVEC培养及代谢分析、人冠状动脉样本ISH-PLA检测等多个独立证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
Apoe−/−背景的SMC特异性Pdgfrb敲除小鼠(Myh11-CreERT2谱系示踪) Apoe−/−背景的EC特异性Il1r1敲除小鼠(Cdh5-CreERT2谱系示踪) 人冠状动脉稳定病变组织 体外培养的小鼠主动脉SMC和HUVEC
重点核对
SMC特异性敲除PDGFRB后，Myh11-eYFP+细胞在病变和纤维帽中的减少程度 Western diet喂养时长(18周 vs 26周)对斑块稳定性指标的影响 EC特异性敲除IL1R1后，Cdh5-eYFP+ACTA2+细胞在纤维帽中的比例 PDGF和TGFβ诱导SMC-MFT时，Galloflavin和CPI613对ECM基因表达的影响 Imatinib处理对小鼠纤维帽SMC和ACTA2+细胞数量及死亡率的影响
摘要
稳定的动脉粥样硬化斑块以富含细胞外基质(ECM)的厚纤维帽为特征，纤维帽内充满保护性的ACTA2+肌成纤维细胞(MF)样细胞，通常被认为几乎完全来源于平滑肌细胞(SMC)。在此，我们表明在小鼠和人类病变中，分别有20%至40%的ACTA2+纤维帽细胞来源于非SMC来源，包括经历内皮-间质转化(EndoMT)或巨噬-间质转化(MMT)的内皮细胞(EC)或巨噬细胞。此外，我们发现，在喂食西方饮食(WD)18周的Apoe−/−小鼠中，SMC特异性敲除血小板衍生生长因子受体β(PDGFRB)导致头臂动脉(BCA)病变几乎完全没有SMC，但病变大小、重塑或稳定性指标(包括ACTA2+纤维帽细胞百分比)没有变化。然而，延长WD喂养SMC-PDGFRB敲除小鼠导致稳定性指标降低，表明EndoMT和MMT来源的MF不能无限期补偿SMC来源MF的损失。通过对BCA区域的单细胞和批量RNA-seq分析以及体外模型，我们提供证据表明SMC向MF转变(SMC-MFT)由PDGF和TGFβ诱导，并依赖于有氧糖酵解，而EndoMT由IL1β和TGFβ诱导。总之，我们提供的证据表明，ACTA2+纤维帽起源于多种细胞类型组成的‘挂毯’，这些细胞通过不同的信号通路转变为MF状态，这些通路要么依赖于广泛的代谢重编程，要么与之相关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 动脉粥样硬化斑块纤维帽中ACTA2+细胞的来源是否仅限于平滑肌细胞，以及不同来源细胞通过何种机制维持纤维帽稳定性？
- 核心机制
- SMC向肌成纤维细胞转化(SMC-MFT)依赖于PDGFRB信号和有氧糖酵解，而内皮细胞向间充质转化(EndoMT)依赖于IL1信号；当SMC来源的MF不足时，EndoMT和MMT可暂时维持稳定性，但长期无法代偿。
- 主要证据
- SMC特异性敲除PDGFRB后SMC投资减少90%但18周时斑块稳定性不变，26周时稳定性降低；EC特异性敲除IL1R1使EndoMT来源的ACTA2+细胞减少50%以上；体外实验显示PDGF/TGFβ诱导的SMC-MFT依赖有氧糖酵解，IL1β/TGFβ诱导HUVEC发生EndoMT。
- 研究意义
- 研究挑战了纤维帽ACTA2+细胞几乎全由SMC来源的传统观点，提出通过增强PDGFRB信号或有氧糖酵解来稳定斑块的治疗策略，并提示临床使用PDGFRB抑制剂可能增加心血管风险。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
18周WD后BCA病变表型分析
评估SMC-PDGFRB缺失对病变大小、SMC投资和稳定性指标的影响。
对PdgfrbSMC-Δ/Δ和WT/WT小鼠的头臂动脉(BCA)进行组织学分析，包括Myh11-eYFP+细胞计数、ACTA2+纤维帽细胞百分比、胶原含量(PicroSirius Red)、斑块内出血(Ter119)、坏死核心面积和病变形态学。
转录组分析(RNA-seq和scRNA-seq)
揭示SMC-PDGFRB缺失后病变中的转录改变，特别是代谢通路的改变。
对PdgfrbSMC-Δ/Δ和WT/WT小鼠的BCA区域进行bulk RNA-seq，并对分离的细胞(分选的Myh11-eYFP+ SMC、未分选的中膜/外膜细胞、未分选的病变细胞)进行scRNA-seq，通过UMAP聚类和KEGG通路分析识别差异表达通路。
纤维帽细胞来源鉴定
确定ACTA2+纤维帽细胞中来自SMC、EC和巨噬细胞的比例。
使用谱系示踪小鼠(Myh11-eYFP和Cdh5-eYFP)对ACTA2+细胞进行共标记，通过免疫荧光和单细胞计数评估SMC来源(Myh11-eYFP+)、EndoMT(CD31+)和MMT(LGALS3+)的贡献；并在人冠状动脉稳定病变中通过ISH-PLA检测MYH11启动子H3K4me2表观遗传标记来区分SMC来源。
长期(26周)WD喂养后表型分析
评估SMC-PDGFRB缺失的长期效应，即非SMC来源的MF是否能维持斑块稳定性。
将PdgfrbSMC-Δ/Δ和WT/WT小鼠喂食WD 26周，分析Myh11-eYFP+细胞、ACTA2+细胞、胶原含量、斑块内出血和EndoMT/MMT标记。
晚期病变中PDGFRB敲除与药物抑制
模拟临床干预，检验在已形成的晚期病变中破坏PDGFRB信号对纤维帽组成和稳定性的影响。
在WD喂养16-18周后注射他莫昔芬诱导SMC中Pdgfrb敲除(延迟敲除)，继续WD 8周后分析；另对Myh11-eYFP小鼠喂食WD 18周后腹腔注射Imatinib(100mg/kg/天)或生理盐水7天，评估纤维帽细胞组成和死亡率。
体外代谢重编程实验
验证SMC-MFT和EndoMT是否依赖特定的代谢途径(有氧糖酵解或氧化磷酸化)。
从小鼠胸主动脉分离Myh11-eYFP+ SMC，用PDGF和TGFβ诱导MFT，并用LDH抑制剂Galloflavin和PDHC抑制剂CPI613处理；另用HUVEC经IL1β和TGFβ诱导EndoMT，检测ECM基因表达和生物能量表型(Seahorse分析)。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型构建 | 他莫昔芬 | Sigma | T-5648 |
| 动脉粥样硬化造模 | 西方饮食 | Harlan Teklad | 88137 |
| 免疫组化 | 抗GFP抗体 | Abcam | ab6673 |
| 抗PDGFRB抗体 | Abcam | ab32570 | |
| 抗CD31抗体 | Abcam | ab124430 | |
| 抗LGALS3抗体 | Cedarlane | CL8942AP | |
| 抗MKi67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 抗cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling | 9661S | |
| 抗MYH11抗体 | Kamiya Biomedical Company | MC-352 | |
| ACTA2-FITC | Sigma | F3777 | |
| ACTA2-Cy3 | Sigma | C6198 | |
| 二抗驴抗山羊488 | Invitrogen | A11055 | |
| 二抗驴抗大鼠Dylight 550 | Abcam | ab102261 | |
| 二抗驴抗兔555 | Invitrogen | A21206 | |
| 二抗驴抗山羊647 | Invitrogen | A21447 | |
| 二抗驴抗大鼠Dylight 650 | Abcam | ab102263 | |
| Ter119抗体 | Santa-Cruz Biotechnology, Inc | -- | |
| DAB显色剂 | Acros Organics | -- | |
| 兔二抗 | Vector Labs | BA-4001 | |
| 免疫荧光 | DAPI | ThermoFisher Scientific | D3571 |
| Prolong Gold防淬灭封片剂 | Invitrogen | -- | |
| ISH-PLA | Duolink探针抗小鼠MINUS | Millipore Sigma | DUO92004 |
| Duolink探针抗兔PLUS | Millipore Sigma | DUO92002 | |
| In Situ Orange检测试剂 | Millipore Sigma | DUO92007 | |
| 小鼠H3K4me2抗体 | Millipore Sigma | 05-1338 | |
| 兔生物素抗体 | Abcam | ab53494 | |
| Duolink原位封片剂(含DAPI) | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| 人Cot-1 DNA | Millipore Sigma | 11581074001 | |
| 细胞分离 | 胶原酶混合物 | Sigma | -- |
| Liberase消化混合液 | Sigma | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | 11320-033 |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH3007.03 | |
| 人脐静脉内皮细胞 | Lonza | -- | |
| 人冠状动脉平滑肌细胞 | Lonza | -- | |
| 药物处理 | 重组PDGF-DD | -- | -- |
| 重组TGFβ1 | -- | -- | |
| 重组IL1β | -- | -- | |
| 重组TGFβ2 | -- | -- | |
| 没食子黄素 | -- | -- | |
| CPI613 | -- | -- | |
| FX-11 | -- | -- | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | -- | -- | |
| 甲磺酸伊马替尼 | Selleckchem | -- | |
| qPCR | RNEasy微型试剂盒 | Qiagen | -- |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| SensiFast SYBR No-ROX预混液 | -- | -- | |
| Bio-Rad CFX56实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 代谢分析 | Seahorse XF24细胞能量代谢分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| 寡霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| BAM15 | Cayman Chemical Company | -- | |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 葡萄糖 | -- | -- | |
| RNA-seq | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| scRNA-seq | Chromium 10X基因组文库构建试剂盒 | 10x Genomics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、性别(Myh11-CreERT2仅限于雄性)、他莫昔芬给药方案(剂量、时间)、Western diet喂养时间(18或26周)、PDGFRB或IL1R1敲除效率 阅读提示：Methods: Animal Handling and Tissue Processing; PDGFRB deletion in smooth muscle cells in vivo; Endothelial cell lineage-tracing in vivo |
| 组织学分析 | 纤维帽定义(30μm管腔下区域)、单细胞计数方法、盲法保证、PicroSirius Red和Ter119染色的定量方法 阅读提示：Methods: Determining fibrous cap area in murine lesions; Single cell counting and image analysis |
| 体外SMC-MFT实验 | SMC分离方法(胸主动脉)、血清饥饿时间、PDGF和TGFβ浓度(10-50ng/mL)、Galloflavin和CPI613浓度、处理时间(24-72小时)、Seahorse实验细胞密度 阅读提示：Methods: Cell Culture; Metabolic Flux Measurements |
| 体外EndoMT实验 | HUVEC培养条件、细胞融合度、IL1β和TGFβ2浓度(10ng/mL)、处理时间(4-6天)、qPCR基因 阅读提示：Methods: Cell Culture; Quantitative Real-Time PCR |
| 人样本ISH-PLA | 人冠状动脉标本来源、ISH-PLA效率校正方法、纤维帽区域手动识别、自动计数参数 阅读提示：Methods: ISH-PLA and immunofluorescence staining of human tissue |