MG-PACE连续进化系统的建立
建立一个能够将分子胶三元复合物形成与基因表达偶联的进化系统，用于后续desired活性蛋白的连续进化。
构建了基于rapamycin响应的细菌双杂交系统，将FKBP12与DNA结合蛋白RR69融合，FRB与RNA聚合酶ω亚基融合，通过rapamycin诱导的FKBP12-FRB结合驱动报告基因luxAB表达，并优化了细菌通透性以改善小分子响应。
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选择性分子胶调控的紧凑蛋白质降解标签的连续进化
Continuous evolution of compact protein degradation tags regulated by selective molecular glues.
实验完整度
高包含分子胶复合物连续进化系统开发、体外生化结合实验、细胞功能验证、内源基因编辑敲入、冷冻电镜结构解析及体内（细胞）降解验证，多层级验证。
主要模型
HEK293T稳定细胞系 K562细胞系 小鼠3T3细胞 MM1.S细胞
重点核对
PT-179（1 μM）处理48小时进行转录组分析 pomalidomide（1 μM）处理48小时作为对照 HEK293T细胞中稳定表达SD40-eGFP，PT-179处理5和24小时进行蛋白质组学分析 Twin prime editing在HEK293T细胞中插入SD40至PLK1的编辑效率（26% ± 8.8% indel） SD40在K562细胞中插入至BRD4的编辑效率（7.7% ± 4.3% indel）
摘要
条件性蛋白质降解标签（degrons）通常大于100个氨基酸，或者由具有显著脱靶效应的小分子触发，这阻碍了它们作为内源蛋白质水平特异性调节剂的使用。我们开发了一个噬菌体辅助的分子胶复合物连续进化平台（MG-PACE），并进化出一个36氨基酸的锌指（ZF）降解标签（SD40），该标签结合泛素连接酶底物受体cereblon与PT-179的复合物，PT-179是一种正交的沙利度胺衍生物。使用prime editing将SD40框内标记的内源蛋白被原本惰性的PT-179降解。SD40与配体结合的cereblon复合物的冷冻电镜结构揭示了SD40活性和特异性的分子基础。我们的工作建立了一个用于分子胶复合物和ZF标签连续进化的系统，克服了现有降解标签的缺点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何获得一种小型、可被正交小分子调控且无脱靶效应的蛋白质降解标签，以用于内源蛋白的精准调控？
- 核心机制
- 通过MG-PACE连续进化，获得36氨基酸的锌指降解标签SD40，其与cereblon（CRBN）结合态下的PT-179形成高亲和力三元复合物，并通过C端尾部与CRBN N端结构域相互作用，促进CRBN闭合构象，从而介导靶蛋白的泛素化和降解。
- 主要证据
- 进化出SD40降解标签；通过BLI和TR-FRET测定其与CRBN•PT-179的高亲和力（KD = 123 nM）；通过冷冻电镜结构解析了复合物结构；在HEK293T和K562细胞中利用prime editing实现内源基因标记，PT-179处理导致靶蛋白快速降解。
- 研究意义
- 本研究建立的MG-PACE平台和SD40标签，为在人和小鼠细胞中精确操控蛋白水平提供了工具，有望用于研究蛋白功能和验证潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
正交IMiD衍生物PT-179的特性验证
确认PT-179作为无脱靶效应的正交IMiD衍生物，其与CRBN结合能力与pomalidomide相当。
在多种人类细胞系（MOLT4、KELLY、HEK293T、MM1.S）中，比较PT-179和pomalidomide对已知新底物（IKZF1、ZFP91、SALL4）的降解作用及转录组变化，通过蛋白质组学、RNA-seq、荧光偏振和BRET实验分析其选择性。
ZF降解标签的进化
进化出能够特异性结合CRBN•PT-179的锌指降解标签，并提高其亲和力和选择性。
基于SD0起始序列，使用MG-PACE和PANCE进行多轮进化，结合分步进化策略（先使用较小取代基的IMiD衍生物作为垫脚石，再增加选择压力），最终获得SD36和SD40等变体。
SD40标签的功能验证
验证SD40作为降解标签在细胞中能够响应PT-179触发靶蛋白降解，并评估其广谱性和选择性。
在HEK293T细胞中表达SD40与多种蛋白（eGFP、Nluc、Fluc、PRKRA）的融合蛋白，用PT-179处理，通过荧光显微镜、Western blot或酶活性检测评估降解效率；进行蛋白质组学分析检查脱靶效应。
内源基因的prime editing敲入
将SD40精确插入内源基因，在基因组水平上验证对标签蛋白的调控。
使用twin prime editing在HEK293T细胞中于PLK1基因终止密码子前插入SD40，在K562细胞中于BRD4基因起始密码子后插入SD40，筛选纯合细胞系，并检测PT-179处理后靶蛋白的降解。
体外结合动力学分析
定量测定SD40与CRBN•PT-179的亲和力和结合动力学，验证进化后标签的结合特性。
表达纯化MBP-SD40和DDB1ΔBPB•CRBN复合物，利用BLI和TR-FRET测定SD0和SD40与CRBN•pomalidomide或CRBN•PT-179的结合参数。
冷冻电镜结构解析
解析SD40与CRBN•PT-179复合物的高分辨率结构，揭示其结合模式和作用机制。
制备DDB1ΔBPB•CRBN•PT-179•SD40复合物，利用冷冻电镜收集数据，通过单颗粒分析获得约2.4-2.5 Å分辨率的密度图，构建并精修模型，分析界面相互作用。
小鼠CRBN兼容标签的进化
进化出能够与小鼠CRBN结合并响应PT-179的降解标签，以扩大应用范围。
构建mmCRBN MG-PACE电路，以SD36为起点进行PACE进化，并通过竞争性选择压力（表达SD55-MBP融合蛋白）提高亲和力，获得SD56变体，并验证其在3T3细胞中的降解活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
分子胶复合物连续进化系统
验证免疫效应
验证机制链路
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 噬菌体辅助连续进化 | 多粘菌素B九肽 | -- | -- |
| 药物处理 | 泊马度胺 | Combi-Blocks | -- |
| RNA-seq | RNeasy 迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| Smart-seq2 | Illumina | -- | |
| 蛋白质组学 | TimsTOF Pro2 质谱仪 | Bruker Daltonics | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| 生化结合实验 | Tecan Infinite M1000 Pro 微孔板读数仪 | Tecan | -- |
| 细胞培养 | DMEM, GlutaMAX 培养基 | ThermoFisher Scientific | -- |
| RPMI 1640 培养基 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 胎牛血清 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 重组小鼠IL-3 | PropecBio | CYT-371 | |
| 分子克隆 | Phusion U 多重 PCR 预混液 | Thermo Fischer | F562L |
| GoTaq Green 预混液 | Promega | M712B | |
| BsmBI-v2 限制酶 | NEB | R0739 | |
| T4 DNA 连接酶 | NEB | M0202 | |
| ZymoPURE II 质粒中提试剂盒 | Zymo Research | D4200 | |
| QIAGEN 质粒中提试剂盒 | Qiagen | 12143 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 128104 | |
| One Shot Stbl3 化学感受态细胞 | Thermo Fischer Scientific | C737303 | |
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 蛋白质纯化 | HisPur Ni-NTA 树脂 | Thermo Fisher Scientific | 88221 |
| Amicon Ultra-15 离心过滤装置（30 kDa截留分子量） | Millipore Sigma | UFC903096 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL 凝胶过滤柱 | Cytiva | -- | |
| Superdex75 凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| 抗DYKDDDDK G1 亲和树脂 | Genscript | -- | |
| Poros 50 HQ 阴离子交换柱 | ThermoFisher | -- | |
| 苯zonase 核酸酶 | -- | -- | |
| 免疫印迹 | Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| NuPAGE LDS 样品缓冲液 | Thermo | NP0007 | |
| iBlot 2 转印仪 | Invitrogen | IB21001 | |
| Odyssey 成像系统 | LI-COR | -- | |
| 抗HA标签抗体 | Cell Signaling | 3724 | |
| 抗BRD4抗体 | Cell Signaling | 13440 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling | 5174 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Bioss | bsm-33034M | |
| 抗PLK1抗体 | Cell Signaling | 4513 | |
| 抗GFP抗体 | Cell Signaling | 2956 | |
| 羊抗兔 680RD 二抗 | LI-COR | 926-68071 | |
| 羊抗鼠 680RD 二抗 | LI-COR | 926-68070 | |
| 流式细胞术 | CytoFLEX S 流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| CytoFLEX LX 流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 基因组编辑 | Lonza 4D-Nucleofector 核转染仪 | Lonza | -- |
| ALT-R v3 S.p. Cas9 核酸酶 | IDT | -- | |
| 冷冻电镜 | Quantifoil UltrAuFoil R 1.2/1.3 载网 | Quantifoil | -- |
| PELCO easiGlow 辉光放电仪 | PELCO | -- | |
| Leica EM-GP 投入式冷冻仪 | Leica | -- | |
| Talos Arctica 透射电镜 | Thermo Scientific | -- | |
| Titan Krios 透射电镜 | Thermo Scientific | -- | |
| Gatan K3 直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| 生化结合实验 | Octet 系统 | Sartorius | -- |
| 链霉亲和素包被的光学探针 | Sartorius | 18-5019 | |
| 铽偶联链霉亲和素 | -- | -- | |
| 细胞信号检测 | NanoBRET 检测试剂盒 | Promega | N2910 |
| 测序 | Illumina NextSeq 550 测序仪 | Illumina | -- |
| Illumina MiSeq 测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MG-PACE连续进化 | 使用的大肠杆菌菌株（S2060），辅助质粒和诱变质粒，PMBN浓度（3 μg/mL），目标IMiD衍生物浓度（10 μM至500 nM） 阅读提示：Materials and Methods: Phage-assisted continuous evolution (PACE) 和 Phage-assisted non-continuous evolution (PANCE) |
| 正交IMiD衍生物筛选 | 细胞系（MOLT4、KELLY、HEK293T、MM1.S），处理浓度（1 μM），处理时间（5、24、48小时），对照组设置（DMSO） 阅读提示：Results: Orthogonal IMiD derivatives with no detected off-target neosubstrates; Methods: Transcriptome-wide RNA sequencing, Global quantitative proteomics sample preparation |
| 降解标签功能验证 | 细胞系（HEK293T、3T3），融合蛋白构建（eGFP、Nluc、Fluc、PRKRA），PT-179浓度梯度，处理时间（≥20小时），对照（DMSO） 阅读提示：Results: Identification of SD40, a compact PT-179-dependent degradation tag; Methods: Flow cytometry analysis, Immunoblots |
| 内源基因Prime Editing敲入 | 靶基因（PLK1、BRD4），prime editor构建（PE6c等），pegRNA序列，编辑条件（转染量、时间），编辑效率评估方法 阅读提示：Results: SD40 can be installed in target genes via prime editing; Methods: Prime editing in HEK293T cells, Prime editing in K562 cells |
| 体外结合动力学 | 蛋白浓度（MBP-SD40，DDB1ΔBPB•CRBN），化合物（PT-179、pomalidomide）浓度，缓冲液组成，BLI和TR-FRET实验参数 阅读提示：Results: SD40 tightly binds CRBN•PT-179 in vitro; Methods: Biolayer interferometry (BLI), Time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) assays |
| 冷冻电镜结构解析 | 复合物制备浓度（DDB1ΔBPB•CRBN 10.5 μM，PT-179 105 μM，SD40 21 μM），冷冻电镜数据收集参数（加速电压、探测器、像素大小），数据处理软件 阅读提示：Methods: EM sample preparation and data collection, Data processing and model building |