富勒醇C60对七氟醚处理的大鼠下肢缺血再灌注损伤中肺和肾组织的影响

Effect of fullerenol C60 on lung and renal tissue in lower extremity ischemia‑reperfusion injury in sevoflurane‑treated rats.

作者信息Ayşe Hande Arpaci, Zeynep Köksal, Zeynep Yiğman, Ayşegül Küçük, Volkan Şivgin, Mustafa Arslan, Mustafa Kavutçu, Saadet Özen Akarca Di Zakar
PMID38334145
发布时间2024-03
DOI10.3892/mmr.2024.13178

实验完整度

包含体外动物模型(大鼠下肢IR模型)、组织病理学、免疫组化和生化检测,但缺少分子机制验证(如Western blot)和多层证据。

主要模型

Wistar白化大鼠下肢缺血再灌注模型 肺组织 肾组织

重点核对

大鼠品系:Wistar白化雄性大鼠,8月龄,体重225-275g 分组:Sham、IR、IR-FUL、IR-SEVO、IR-FUL-SEVO,每组6只 下肢IR诱导:腹主动脉夹闭120分钟,再灌注120分钟 富勒醇C60给药:100 mg/kg腹腔注射,缺血前30分钟 七氟醚给药:2.3%吸入浓度,4 L/min,100% O2,4小时

摘要

本研究的目的是探讨富勒醇C60对七氟醚处理的大鼠下肢缺血再灌注(IR)损伤中肺和肾组织的影响。共使用30只体重225-275克的Wistar白化大鼠,平均分为五组(每组n=6):i) 假手术组;ii) IR组;iii) IR-富勒醇C60组(IR-FUL);iv) IR-七氟醚组;v) IR-富勒醇C60-七氟醚组(IR-FUL-SEVO)。富勒醇C60在下肢IR诱导前腹腔注射,七氟醚在IR损伤期间给药。随后进行肺和肾组织病理学检查以及血清生化分析。与假手术组相比,IR组肺组织显示明显充血和中性粒细胞浸润增加,治疗组与IR组相比充血和中性粒细胞浸润显著减少。在肾脏样本的组织病理学评估中,所有经历IR的组均观察到空泡变性、肾小管上皮细胞刷状缘丢失、肾小管上皮脱落和不同程度的肾小管损伤。所有IR组的平均肾小管损伤评分均显著高于假手术组。此外,IR-FUL和IR-FUL-SEVO组的平均肾损伤评分显著低于IR组。观察到肺和肾组织中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素1β和细胞间黏附分子1的表达水平在IR后升高,并在富勒醇C60和七氟醚治疗组中降低。值得注意的是,IR-FUL组细胞因子表达的降低最为显著。检查肺和肾中的氧化状态参数时,与IR组相比,接受七氟醚或富勒醇C60治疗的组中硫代巴比妥酸反应物质水平、过氧化氢酶和谷胱甘肽S-转移酶活性显著不同。本研究证明了在建立下肢IR后,富勒醇C60对七氟醚麻醉下大鼠肺和肾组织的保护作用。本研究的结果表明,富勒醇C60可减少下肢IR后肺和肾的氧化和组织病理学损伤。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
富勒醇C60单独或与七氟醚联合使用,对七氟醚麻醉下大鼠下肢缺血再灌注引起的肺和肾损伤是否具有保护作用?
核心机制
富勒醇C60通过其抗氧化特性减少氧化应激,并降低炎症因子(TNF-α、IL-1β、ICAM-1)表达和细胞凋亡(BAX、CASP-3)以及增加BCL-2表达,从而保护肺和肾组织。
主要证据
大鼠下肢IR模型,组织病理学评分显示IR-FUL和IR-FUL-SEVO组肺和肾损伤评分显著降低;免疫组化显示炎症和凋亡标志物表达下降;生化检测显示TBARS水平降低,CAT和GST活性升高。
研究意义
富勒醇C60可能作为下肢缺血再灌注损伤的潜在抑制剂,首次在七氟醚麻醉下下肢IR模型中研究其对远隔器官损伤的保护作用。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立下肢缺血再灌注模型

模拟下肢缺血再灌注损伤,为评估干预措施提供模型。

大鼠麻醉后行中线剖腹术,用微血管夹夹闭腹主动脉120分钟,恢复灌注120分钟。

2

药物处理

评估富勒醇C60和七氟醚单独或联合对IR损伤的影响。

IR-FUL组在缺血前30分钟腹腔注射富勒醇C60;IR-SEVO组在IR期间吸入七氟醚;IR-FUL-SEVO组同时给予富勒醇C60和七氟醚。

3

组织病理学评估

评估肺和肾组织的组织病理学损伤程度。

肺和肾组织经固定、包埋、切片,进行H&E染色,肾组织另做PAS染色,光镜下观察并评分。

4

免疫组织化学评估

检测炎症和凋亡相关蛋白的表达变化。

肺和肾组织切片用TNF-α、IL-1β、ICAM-1抗体染色;肾组织另用BAX、BCL-2、CASP-3抗体染色,评估免疫阳性面积。

5

TUNEL凋亡检测

评估肾小管上皮细胞凋亡情况。

肾组织切片进行TUNEL染色,计数TUNEL阳性细胞数。

6

生化指标检测

评估氧化应激状态。

肺和肾组织匀浆,检测TBARS水平、CAT和GST活性,以评估脂质过氧化和抗氧化酶活性。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Rompun----
肝素钠----
富勒醇C60MilliporeSigma99685-96-8
七氟醚----
Heidolph匀浆器DIAX 900Heidolph Instruments GMBH & CO. KG--
牛血清白蛋白MilliporeSigma--
10%中性缓冲福尔马林----
Leica RM2245旋转切片机Leica Microsystems GmbH--
伊红----
Ultra V Block溶液Thermo Fisher Scientific, Inc.TA-125-UB
抗TNF-α抗体Elabscience Biotechnology, Inc.E-AB-33121
抗IL-1β抗体Elabscience Biotechnology, Inc.E-AB-66749
抗ICAM-1抗体BIOSSbs-0608R
抗BAX抗体BIOSSbs-0127R
抗BCL-2抗体BIOSSbs-4563R
抗CASP-3抗体Elabscience Biotechnology, Inc.E-AB-66940
生物素化二抗Thermo Fisher Scientific, Inc.TP-125-BN
HRP标记链霉亲和素Thermo Fisher Scientific, Inc.TS-125-HR
DAB显色剂----
Leica DM4000 B光学显微镜Leica Microsystems GmbH--
ImageJ软件National Institutes of Health--
TUNEL检测试剂盒Elabscience Biotechnology, Inc.E-CK-A331-50T
Entellan new封片剂MilliporeSigma107961
SPSSIBM Corp.--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型和分组
大鼠品系、年龄、体重、性别;每组样本量;分组方式(Sham、IR、IR-FUL、IR-SEVO、IR-FUL-SEVO)
阅读提示:Materials and methods: Animals and experimental protocol
IR诱导
夹闭位置(腹主动脉)、夹闭时间(120分钟)、再灌注时间(120分钟)、肝素剂量(500 IU/kg)和给药途径(尾静脉)
阅读提示:Materials and methods: Animals and experimental protocol
药物处理
富勒醇C60剂量(100 mg/kg)、给药途径(腹腔)、给药时间(缺血前30分钟);七氟醚浓度(2.3%)、流量(4 L/min)、氧气浓度(100%)、持续时间(4小时)
阅读提示:Materials and methods: Animals and experimental protocol
组织病理学评估
固定液及时间(10%中性福尔马林,72小时)、切片厚度(4 µm)、染色方法(H&E、PAS)、评分标准(肺:ATS标准;肾:半定量评分0-5)
阅读提示:Materials and methods: Histopathological assessment
免疫组化
抗原修复(柠檬酸盐缓冲液pH 6.0,85°C,2小时)、一抗稀释度及来源、二抗和链霉亲和素孵育时间、DAB显色
阅读提示:Materials and methods: Immunohistochemical assessment
TUNEL检测
TUNEL试剂盒型号(E-CK-A331-50T)、染色步骤(按厂家方案)、封片剂(Entellan new)、计数方法(10个随机视野,×400)
阅读提示:Materials and methods: TUNEL assay for kidney samples
生化检测
组织匀浆条件(Heidolph匀浆器,1000 U,3分钟)、离心条件(10,000×g,10分钟,4°C)、TBARS、CAT、GST检测方法、蛋白质定量(Lowry法)
阅读提示:Materials and methods: Biochemical analysis