构建C4BPA基因敲除BMECs系模型
建立C4BPA基因敲除的牛乳腺上皮细胞系，以研究其功能。
设计靶向C4BPA外显子4的sgRNA，构建重组质粒，转染BMECs，通过流式筛选阳性细胞，经PCR和测序验证敲除效果。
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补体成分4结合蛋白α基因：一个影响牛乳腺上皮细胞系脂质代谢的多功能免疫基因
The Complement Component 4 Binding Protein α Gene: A Versatile Immune Gene That Influences Lipid Metabolism in Bovine Mammary Epithelial Cell Lines.
实验完整度
高包含CRISPR/Cas9基因敲除细胞模型构建、细胞增殖与凋亡检测、脂质含量测定、脂肪酸GC-MS分析、RNA-seq及qPCR验证、Western blot等多层级体外实验验证。
主要模型
牛乳腺上皮细胞系（BMECs） C4BPA基因敲除BMECs系
重点核对
CRISPR/Cas9敲除C4BPA基因（sgRNA靶向外显子4） 细胞培养条件：DMEM/F12培养基，10% FBS，37°C，5% CO2 敲除验证：PCR扩增产物656 bp（WT）与296 bp（KO） 脂质含量测定：TG、CHOL、FFA试剂盒 脂肪酸分析：GC-MS
摘要
补体成分4结合蛋白α（C4BPA）是一种免疫基因，通过结合并灭活经典补体3（C3）转化酶途径中的补体成分C4b（C4b），负责C4BP的补体调节功能。我们先前的研究结果通过比较中国荷斯坦奶牛高脂和低脂牛乳腺上皮细胞系（BMECs）的转录组，发现C4BPA存在差异表达。在本研究中，利用CRISPR/Cas9系统构建了C4BPA基因敲除的BMECs系模型，以研究C4BPA在脂质代谢中的功能。结果显示，在BMECs中敲除C4BPA后，甘油三酯（TG）水平升高，而胆固醇（CHOL）和游离脂肪酸（FFA）水平降低（p < 0.05）。此外，大多数种类的脂肪酸主要富集在不饱和脂肪酸的生物合成、亚油酸代谢、脂肪酸生物合成和脂肪细胞中的脂肪分解调节通路。同时，RNA-seq显示大多数差异表达基因（DEGs）与PI3K-Akt信号通路相关。当C4BPA基因被敲除时，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶1（HMGCS1）、肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）、脂肪酸去饱和酶1（FADS1）和硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）的表达显著改变。总之，C4BPA基因作为一个免疫基因，在BMECs的脂质代谢中发挥重要作用。这些发现为动物育种者提供了一条新途径：应合理利用这一具有多种功能的基因。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- C4BPA基因作为免疫基因，在牛乳腺上皮细胞中是否及如何影响脂质代谢？
- 核心机制
- C4BPA可能通过PI3K-Akt信号通路调控脂质代谢，影响HMGCS1、CPT1A、FADS1和SCD1等脂质代谢相关基因的表达。
- 主要证据
- 利用CRISPR/Cas9敲除C4BPA基因后，TG含量升高，CHOL和FFA含量降低；脂肪酸谱改变；RNA-seq显示DEGs富集于PI3K-Akt通路；RT-qPCR和Western blot验证关键基因表达变化。
- 研究意义
- 为奶牛育种中综合选择乳脂性状和免疫性状提供新依据，并构建了C4BPA敲除细胞系为后续功能研究提供工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测C4BPA敲除对细胞增殖和凋亡的影响
验证敲除C4BPA后细胞增殖和凋亡是否发生改变，以确保细胞模型可用。
使用流式细胞术检测细胞凋亡，CCK-8检测细胞增殖。
分析脂质积累和TG、CHOL、FFA含量
确定C4BPA敲除对脂质积累和主要脂质组分的影响。
使用BODIPY染色观察脂滴，使用试剂盒检测TG、CHOL、FFA含量。
基于GC-MS的脂肪酸含量分析
探究C4BPA敲除对脂肪酸组成的影响。
提取细胞内脂肪酸，使用GC-MS检测脂肪酸含量和组成。
RNA-seq分析差异表达基因
在转录组水平揭示C4BPA敲除后差异表达基因及富集通路。
提取RNA进行RNA-seq，鉴定DEGs，并进行KEGG和GO富集分析，用RT-qPCR验证10个基因。
验证脂质代谢相关基因表达
验证C4BPA敲除后特定脂质代谢基因的表达变化。
使用Western blot检测HMGCS1、CPT1A、FADS1、SCD1的蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因编辑与细胞模型构建
验证细胞功能变化
脂肪酸分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | GIBCO | -- |
| 胎牛血清 | PAA | -- | |
| 6孔板 | Falcon | -- | |
| Opti MEM培养基 | GIBCO | -- | |
| 不含EDTA的胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 微量DNA提取试剂盒 | -- | -- | |
| 基因敲除 | 48138-EGFP-puro质粒 | -- | -- |
| sgRNA（C4BPA-sgRNA1-F） | 上海生工 | -- | |
| sgRNA（C4BPA-sgRNA1-R） | 上海生工 | -- | |
| sgRNA（C4BPA-sgRNA2-F） | 上海生工 | -- | |
| sgRNA（C4BPA-sgRNA2-R） | 上海生工 | -- | |
| 流式分选 | FACS Aria III流式分选仪 | Becton, Dickinson and Company | -- |
| RNA提取和定量 | Trizol试剂 | 天根生化 | -- |
| SuperScript第一链合成试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| SYBR Green实时PCR预混液 | 天根生化 | -- | |
| 蛋白检测 | 牛C4b结合蛋白α链ELISA试剂盒 | Vazyme Biotech Company | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Vazyme Biotech Company | -- |
| 脂质含量测定 | 甘油三酯试剂盒 | Applygen Technologies Inc. | -- |
| 胆固醇试剂盒 | Applygen Technologies Inc. | -- | |
| 游离脂肪酸试剂盒 | Applygen Technologies Inc. | -- | |
| 蛋白浓度测定 | NanoDrop 2000微量分光光度计 | Thermo Fisher Scientific Company | -- |
| GC-MS分析 | Agilent 7890B气相色谱仪 | Agilent | -- |
| Agilent 5977B质谱仪 | Agilent | -- | |
| DB-FastFAME毛细管柱 | Agilent | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 抗HMGCS1抗体 | Bioss | bs-5069R | |
| 抗CPT1A抗体 | Bioss | bs-23779R | |
| 抗SCD1抗体 | Bioss | bs-3787R | |
| 抗FADS1抗体 | Bioss | bs-5060R | |
| BeyoECL Plus化学发光试剂 | 碧云天生物技术 | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software Inc. | -- |
| SPSS 23.0 | IBM Corporation | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基，10%FBS，5% CO2，37°C 阅读提示：Materials and Methods 4.1 |
| 基因敲除 | sgRNA序列，转染量（3 μg质粒、6 μL转染试剂、200 μL Opti MEM），流式筛选 阅读提示：Materials and Methods 4.1, 4.2; Table 1 |
| 敲除验证 | PCR产物大小（WT 656 bp, KO 296 bp），测序验证 阅读提示：Materials and Methods 4.3; Results 2.1 |
| 脂质含量测定 | TG、CHOL、FFA试剂盒，n = 3 阅读提示：Materials and Methods 4.6; Results 2.4 |
| 脂肪酸分析 | GC-MS仪器条件，样品前处理步骤 阅读提示：Materials and Methods 4.7, 4.8; Results 2.5 |
| RNA-seq分析 | DESeq2筛选DEGs（p < 0.05），富集分析 阅读提示：Materials and Methods 4.9, 4.10; Results 2.6, 2.7 |
| 蛋白表达验证 | 抗体稀释比例，Western blot步骤 阅读提示：Materials and Methods 4.11; Results 2.8 |