GPR137 表达分析
检测 GPR137 在胃癌组织和细胞中的表达水平
通过 GEPIA 数据库分析 STAD 组织中 GPR137 表达，免疫组化检测 10 对 GC 及癌旁组织，Western blot 检测正常胃上皮细胞和胃癌细胞中 GPR137 蛋白水平
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GPR137 使 Hippo 信号失活以促进胃癌细胞恶性行为
GPR137 inactivates Hippo signaling to promote gastric cancer cell malignancy.
实验完整度
高利用细胞模型、异种移植模型及临床样本，通过功能获得与缺失实验验证 GPR137 对胃癌细胞恶性行为的影响，并通过机制研究揭示其调控 Hippo 信号通路。
主要模型
人胃癌 AGS 细胞 人胃癌 SGC-7901 细胞 人正常胃上皮 GES-1 细胞 裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
GPR137 过表达和敲除对 AGS 细胞增殖、迁移、侵袭、集落形成及体内异种移植瘤生长的影响 GPR137 对 Hippo 信号通路关键蛋白（MST1、LATS1/2、YAP、TAZ）磷酸化及表达水平的影响 GPR137 与 MST1 的蛋白相互作用以及 MST-LATS 复合物形成的改变 MST1/2 敲除对 GPR137 介导的 TEAD 报告活性的影响 YAP/TAZ 敲低对 GPR137 诱导的细胞恶性行为的逆转作用
摘要
作为世界上第五常见的癌症，胃癌（GC）是全球癌症相关死亡的第三大原因。尽管手术切除和化疗仍是 GC 潜在治愈性治疗的主要手段，但化疗耐药和不良副作用限制了其临床应用。因此，进一步研究 GC 的致癌机制和发现新的生物标志物备受关注。我们在此报道 GPR137 的升高表达与 GC 相关。GPR137 的过表达增强了人胃癌 AGS 细胞的恶性行为，包括增殖、迁移、侵袭、集落形成以及裸鼠体内异种移植瘤的生长，而通过 CRISPR/Cas9 基因编辑敲除 GPR137 则发挥相反作用。机制上，GPR137 可与 Hippo 通路的上游激酶 MST 结合，破坏 MST 与 LATS 的关联，进而激活转录共激活因子 YAP 和 TAZ，从而触发靶基因转录并引起 GC 细胞生物学行为的改变。因此，我们的发现可能为开发针对 GC 的特异性靶向新治疗方法提供证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GPR137 在胃癌中表达上调，但其在胃癌发生发展中的作用及分子机制尚不清楚
- 核心机制
- GPR137 与 MST 激酶结合，破坏 MST 与 LATS 的相互作用，抑制 Hippo 信号通路，导致 YAP/TAZ 活化并转入核内，上调 CTGF 和 CYR61 等靶基因表达，从而促进胃癌细胞恶性行为
- 主要证据
- 基于 GEPIA 数据库分析、10 对胃癌及癌旁组织的免疫组化染色、AGS 和 SGC-7901 细胞功能实验、裸鼠异种移植瘤、RNA-seq、TEAD 荧光素酶报告实验、免疫共沉淀和 Western blot 等实验验证
- 研究意义
- 揭示 GPR137 通过抑制 Hippo 信号促进胃癌进展的新机制，提示 GPR137 可作为胃癌的潜在治疗靶点
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
GPR137 功能获得实验
验证过表达 GPR137 对 AGS 细胞恶性行为的影响
通过转染 GPR137 表达质粒或慢病毒感染 AGS 细胞，检测细胞增殖（CCK-8）、迁移（划痕实验）、侵袭（Transwell）、集落形成以及裸鼠异种移植瘤生长
GPR137 功能缺失实验
验证敲除 GPR137 对 AGS 细胞恶性行为及 Hippo 信号的影响
利用 CRISPR/Cas9 敲除 AGS 细胞 GPR137，检测增殖、迁移、侵袭、集落形成，以及 Hippo 通路蛋白磷酸化和 YAP/TAZ 亚细胞分布
转录组分析
探究 GPR137 调控的下游信号通路
对过表达 GPR137 和对照 AGS 细胞进行 RNA-seq，进行 GO 和 KEGG 富集分析，发现 Hippo 信号通路富集显著
Hippo 信号活性检测
验证 GPR137 对 Hippo 信号活性的影响
通过 TEAD 荧光素酶报告实验、qRT-PCR 检测 Hippo 靶基因 CTGF 和 CYR61 表达，以及 Western blot 检测 Hippo 通路蛋白磷酸化水平
机制验证
阐明 GPR137 调控 Hippo 信号的分子机制
通过免疫共沉淀检测 GPR137 与 MST1 相互作用，以及 GPR137 对 MST-LATS 复合物的影响，并在 MST1/2 敲除细胞中检测 GPR137 对 TEAD 活性的影响
功能回复实验
验证 GPR137 通过 Hippo 通路介导细胞恶性行为
在 AGS 细胞中敲低 YAP 和 TAZ，检测 GPR137 诱导的 TEAD 活性及细胞增殖、迁移、侵袭和集落形成是否被逆转
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640 培养基 | Hyclone | -- |
| DMEM 培养基 | Life Technologies | -- | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | -- | |
| CRISPR/Cas9 基因编辑 | pX330-sgGPR137 质粒 | -- | -- |
| 转染 | 脂质体转染试剂 | Invitrogen | -- |
| CRISPR/Cas9 筛选 | 嘌呤霉素 | Invitrogen | -- |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma | -- |
| pCDH-CMV-MCS-EF1-GPR137-copGFP 慢病毒表达载体 | -- | -- | |
| 抗体 | 磷酸化 MST1 抗体 | Bioss | bs-4635R |
| MST1 抗体 | Bioss | bs-3504R | |
| MST2 抗体 | Bioss | bs-4663R | |
| 磷酸化 LATS1 抗体 | Bioss | bs-3245R | |
| GPR137 抗体 | Bioss | bs-16270R | |
| PCNA 抗体 | Bioss | bs-2007R | |
| 磷酸化 LATS2 抗体 | ABclonal | AP0904 | |
| Flag 抗体 | MBL | M185-3 | |
| CTGF 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365970 | |
| CYR61 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-374129 | |
| GAPDH 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| 正常小鼠 IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| LATS1 抗体 | Cell Signaling Technology | #3477 | |
| LATS2 抗体 | Cell Signaling Technology | #5888 | |
| 磷酸化 YAP 抗体 | Cell Signaling Technology | #13008 | |
| YAP 抗体 | Cell Signaling Technology | #14074 | |
| TAZ 抗体 | Cell Signaling Technology | #72804 | |
| 正常兔 IgG | Cell Signaling Technology | #2729 | |
| 磷酸化 TAZ 抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-105066 | |
| HA 标签抗体 | Beyotime Institute of Biotechnology | AF2305 | |
| 药物处理 | XMU-MP-1 | Selleck | -- |
| RNA 提取 | Trizol 试剂 | Takara Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| RT-PCR | SuperScript III 逆转录酶 | Life Technologies | -- |
| 转染 | Lipofectamine 2000 转染试剂 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | -- |
| 荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告实验 | Promega | -- |
| 蛋白印迹 | PVDF 膜 | Millipore | -- |
| 蛋白 A/G 琼脂糖珠 | Santa Cruz | sc-2003 | |
| 免疫荧光 | 腔室载玻片 | Nalge Nunc International | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 细胞增殖 | CCK-8 试剂 | Yeasen | -- |
| 侵袭实验 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| Transwell 小室 | Costar | -- | |
| 动物实验 | BALB/c 裸鼠 | -- | -- |
| 免疫组化 | Histostain-Plus 试剂盒 | Kangwei Reagents | -- |
| DAB 显色液 | -- | -- | |
| RNA-seq | Dynabeads mRNA 纯化试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 片段化缓冲液 | Ambion | -- | |
| Illumina HiSeq 2000 测序平台 | Berry Genomics | -- | |
| 统计分析 | SPSS 13.0J 软件 | SPSS, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GPR137 表达分析 | 临床样本 GPR137 表达（10 对 GC 及癌旁组织） 阅读提示：Materials and methods: Obtainment of human tissue samples; Results: GPR137 expression is up-regulated in GC |
| 细胞增殖 | AGS 细胞培养条件（RPMI 1640+10% FBS，37°C，5% CO2） 阅读提示：Materials and methods: Cell lines and cell culture |
| GPR137 过表达与敲除 | 转染方式（Lipofectamine 2000）、质粒（pCDH-GPR137、pX330-sgGPR137） 阅读提示：Materials and methods: CRISPR/Cas9 to GPR137 construction and transfection; Oligonucleotides, plasmids, viruses and infections |
| TEAD 荧光素酶报告实验 | 转染后检测时间（24h）、内参质粒（pRL/TK） 阅读提示：Materials and methods: Transient transfection and TEAD-luciferase reporter assay |
| 划痕实验 | 细胞密度（4×10^5 细胞/6 孔板）、血清饥饿 12h、迁移时间 24h 阅读提示：Materials and methods: Wound healing assay |
| 侵袭实验 | 细胞数（2×10^5）、Matrigel 比例（1:2）、侵袭时间 24h 阅读提示：Materials and methods: Matrigel invasion assay |
| 异种移植瘤模型 | 小鼠（雌性 Balb/c-nu/nu，6 周龄）、细胞接种数（5×10^6/位点）、接种部位、取材时间（14 天） 阅读提示：Materials and methods: AGS-xenografts and treatments |
| Western blot | 蛋白上样量（50 μg）、一抗孵育条件（4°C 过夜）、二抗孵育（室温 2h） 阅读提示：Materials and methods: Nucleo-cytoplasmic separation assay, western blot and co-immunoprecipitation |