临床样本分析
检测PDGF-BB、CAFs标志物和糖酵解相关蛋白在口腔鳞癌组织中的表达及相关性。
收集84例口腔鳞癌组织和24例癌旁组织，通过免疫组化染色检测PDGF-BB、MCT1、MCT4、LDHA等表达。
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PDGF-BB通过成纤维细胞乳酸限制miR-26a-5p并促进线粒体自噬加速舌鳞状细胞癌
PDGF-BB accelerates TSCC via fibroblast lactates limiting miR-26a-5p and boosting mitophagy.
实验完整度
高包含临床样本分析、体外细胞模型、体内裸鼠移植瘤模型，并进行功能验证（自噬调控、miR-26a-5p过表达）和机制验证（双荧光素酶实验、Western blot）
主要模型
人正常口腔黏膜成纤维细胞（hOMF） 口腔舌鳞状细胞癌细胞系Cal-27 原代培养的CAFs和相邻正常成纤维细胞 BALB/c裸鼠混合移植瘤模型
重点核对
PDGF-BB处理浓度：20 ng/ml，时间：72小时 饥饿处理：无血清DMEM低糖培养基培养48小时 细胞共注射数量：hOMF/CAFs和Cal-27各5×10^6细胞 mdivi-1和CCCP作为自噬抑制剂和增强剂的使用 miR-26a-5p过表达和MCT1基因敲除
摘要
肿瘤微环境和癌症相关成纤维细胞（CAFs）在肿瘤发展中起着关键作用，但其代谢耦合仍不清楚。临床数据显示，口腔舌鳞状细胞癌患者肿瘤微环境中PDGF-BB、CAFs和糖酵解之间呈正相关。在体外，CAFs来源于经PDGF-BB处理的人口腔黏膜成纤维细胞（hOMF），该处理诱导其形成并促进有氧糖酵解。线粒体自噬增强了PDGF-BB诱导的CAF表型形成和有氧糖酵解，而自噬抑制阻断了PDGF-BB诱导的效应。在CAFs中观察到miR-26a-5p的下调；上调miR-26a-5p抑制了PDGF-BB诱导的CAFs中线粒体自噬相关蛋白ULK1、Parkin、PINK1和LC3的表达以及有氧糖酵解。PDGF-BB诱导的CAFs促进了肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、NF-κB信号通路激活和PDGF-BB分泌。因此，PDGF-BB与乳酸诱导的CAF形成和葡萄糖代谢重编程相关。这些发现表明口腔舌鳞状细胞癌的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PDGF-BB是否通过诱导成纤维细胞线粒体自噬和有氧糖酵解产生乳酸，进而促进舌鳞状细胞癌进展？
- 核心机制
- PDGF-BB下调miR-26a-5p，靶向ULK1增强线粒体自噬，导致有氧糖酵解增加和乳酸分泌，乳酸通过MCT1进入肿瘤细胞激活NF-κB通路，促进肿瘤细胞增殖、侵袭和PDGF-BB分泌，形成正反馈环路。
- 主要证据
- 体外实验显示PDGF-BB诱导hOMF和原代成纤维细胞自噬和有氧糖酵解；miR-26a-5p过表达抑制这些效应；乳酸促进Cal-27细胞增殖和迁移，且MCT1敲低减弱此效应；体内混合移植瘤模型验证了CAFs促进肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示了PDGF-BB和乳酸介导的口腔舌鳞状细胞癌细胞与癌症相关成纤维细胞之间的葡萄糖代谢共生效应，为靶向PDGF-BB和/或乳酸逆转肿瘤发生发展奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外诱导成纤维细胞活化模型
验证PDGF-BB是否诱导成纤维细胞向CAF表型转化并发生有氧糖酵解。
hOMF细胞用20 ng/ml PDGF-BB处理72小时，检测α-SMA、FAP表达，以及葡萄糖摄取、乳酸分泌、线粒体呼吸链复合物活性等。
线粒体自噬检测
评估PDGF-BB是否增强饥饿处理的hOMF细胞中的线粒体自噬。
使用JC-1染色、MDC染色、透射电镜、LC3A/B免疫荧光、线粒体自噬染料与溶酶体共定位、Western blot检测自噬相关蛋白。
自噬调控验证
通过抑制或增强线粒体自噬，验证其对PDGF-BB诱导的CAF表型和有氧糖酵解的影响。
使用mdivi-1（自噬抑制剂）和CCCP（增强剂）处理细胞，检测CAF标志物和糖酵解相关蛋白表达及葡萄糖摄取和乳酸分泌。
miR-26a-5p功能验证
探究miR-26a-5p是否通过靶向ULK1调控PDGF-BB诱导的线粒体自噬和有氧糖酵解。
通过miRNA芯片和qRT-PCR检测miR-26a-5p表达；双荧光素酶报告基因验证靶基因ULK1；过表达miR-26a-5p后检测自噬和糖酵解指标。
肿瘤细胞功能验证
验证PDGF-BB诱导的CAFs产生的乳酸是否通过MCT1和NF-κB通路促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移。
用CAF条件培养基或乳酸处理Cal-27细胞，检测增殖、迁移、侵袭及NF-κB通路蛋白；使用CHC和SC75741抑制MCT1和NF-κB；敲低MCT1验证作用。
体内移植瘤模型
在体内验证PDGF-BB诱导的CAFs是否促进肿瘤生长及乳酸代谢轴的作用。
将hOMF或CAFs与Cal-27混合皮下注射裸鼠，测量肿瘤体积和重量，进行HE和免疫组化染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 青霉素 | Gibco | -- | |
| 链霉素 | Gibco | -- | |
| II型胶原酶 | -- | -- | |
| 细胞处理 | 重组人PDGF-BB蛋白 | Peprotech | -- |
| CCCP | Selleck | -- | |
| Mdivi-1 | Selleck | -- | |
| CHC | Selleck | -- | |
| SC75741 | Selleck | -- | |
| 乳酸 | Sigma | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | -- |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Kangwei | -- |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| ECL化学发光试剂 | Millipore | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 反转录系统 | Promega | -- | |
| SYBR Green试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| 双荧光素酶实验 | 双荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- |
| 乳酸检测 | 乳酸检测试剂盒 | BioVision | -- |
| 葡萄糖摄取检测 | 葡萄糖摄取比色检测试剂盒 | Sigma | MAK083 |
| 氧化磷酸化检测 | 线粒体呼吸链复合物I活性检测试剂盒 | 南京建成 | -- |
| 线粒体呼吸链复合物II活性检测试剂盒 | 南京建成 | -- | |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0026 |
| NADH检测 | NADH检测试剂盒 | Beyotime | S0175 |
| ELISA | PDGF-BB ELISA试剂盒 | R&D Systems | DBB00 |
| 线粒体自噬检测 | 线粒体自噬检测试剂盒 | DOJINDO | MD01 |
| 细胞因子芯片 | 人细胞因子抗体芯片1000 | Raybiotech | QAH-CAA-1000 |
| 免疫染色 | DAB底物 | ImmunoPure | -- |
| 免疫荧光 | Dylight 488山羊抗小鼠IgG | Abbkine | -- |
| Dylight 649山羊抗兔IgG | Abbkine | -- | |
| Western blotting | PDGF受体β抗体 | Abcam | ab32570 |
| α平滑肌肌动蛋白抗体 | Abcam | ab5694 | |
| PDGF-BB抗体 | Abcam | ab23914 | |
| FAP-α抗体 | Abcam | ab53066 | |
| β-微管蛋白抗体 | Abcam | ab179513 | |
| GLUT1抗体 | Abcam | ab115730 | |
| Bcl-2抗体 | Abcam | ab32124 | |
| LDH-B抗体 | Abcam | ab240482 | |
| LC3β抗体 | Abcam | ab53066 | |
| MCT4抗体 | Bioss | bs-2698R | |
| LDHA抗体 | Bioss | bs-18205R | |
| 己糖激酶II抗体 | Bioss | bs-9455R | |
| MCT1/SLC16A3抗体 | Bioss | bs-10249R | |
| NF-κB p65抗体 | Servicebio | GB11142 | |
| MT-ND1多克隆抗体 | Servicebio | GB113284 | |
| NF-κB p65 (phospho S536)抗体 | Servicebio | -- | |
| PINK1抗体 | CST | -- | |
| Parkin抗体 | CST | -- | |
| ULK1抗体 | CST | -- | |
| LC3A/B抗体 | CST | -- | |
| AMPK抗体 | CST | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI | Abcam | -- |
| MDC | Sigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | hOMF和Cal-27细胞系来源；饥饿处理条件（无血清DMEM低糖培养基，48小时）；PDGF-BB处理浓度（20 ng/ml）和持续时间（72小时）；原代CAFs和NFs的分离方法 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and treatment; Isolation of human normal primary fibroblasts and CAFs |
| 自噬调控 | mdivi-1和CCCP的使用浓度和时间；MDC染色浓度（100 μM）和孵育时间（30分钟）；线粒体自噬检测试剂盒（DOJINDO MD01）的具体操作步骤 阅读提示：Materials and methods: Assessment of autophagy; Assessment of co-localization of mitophagy dye and lysosomes |
| miR-26a-5p功能实验 | miR-26a-5p过表达载体构建和慢病毒感染方法；双荧光素酶报告基因实验的具体步骤；ULK1作为靶基因的验证 阅读提示：Materials and methods: Plasmid construction and lentivirus Infection; Luciferase assay |
| 肿瘤细胞功能实验 | CAF条件培养基（CAF-CM）的制备比例（2/3:1/3）；乳酸刺激的浓度梯度；CHC和SC75741的处理浓度；MCT1基因敲低的方法和效率验证 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and treatment; Wound healing assay; Transwell invasion assay |
| 体内移植瘤模型 | 裸鼠品系（BALB/c）、周龄（6周）和性别（雄性）；细胞注射数量（5×10^6）；混合比例和注射部位；肿瘤测量频率（每3天）和终点（24天） 阅读提示：Materials and methods: Tumor xenograft model |