小鼠感染模型建立
评估IL-1β缺失对沙门氏菌感染进程和结局的影响。
使用链霉素预处理WT和IL-1β-/-小鼠，口服感染鼠伤寒沙门氏菌SL1334，比较细菌载量、组织病理、存活率。
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沙门氏菌通过诱导白细胞介素1β操纵宿主以驱动致病性
Salmonella manipulates the host to drive pathogenicity via induction of interleukin 1β.
实验完整度
高包含小鼠感染模型、肠道菌群分析、转录组测序、组织学、免疫组化、细胞实验及人类脓毒症数据等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
C57BL/6小鼠（野生型） IL-1β基因敲除小鼠（C57BL/6背景） 鼠伤寒沙门氏菌SL1334口服感染模型 人类脓毒症患者外周血转录组数据
重点核对
小鼠品系：C57BL/6野生型与IL-1β-/-小鼠，8-14周龄 感染剂量：口服107 CFU鼠伤寒沙门氏菌SL1334，或静脉注射105 CFU 链霉素预处理：20 mg灌胃，感染前24小时 万古霉素处理：饮用水中300 mg链霉素和150 mg万古霉素，全程给予 CPN1抑制剂：1.25 mg DL-苄基琥珀酸（10%乙醇）腹腔注射，每8小时一次
摘要
急性胃肠道感染，如鼠伤寒沙门氏菌等胞内病原体感染，会触发促炎细胞因子白细胞介素1β（IL-1β）的释放。然而，IL-1β在肠道防御沙门氏菌中的作用仍不清楚。在此，我们表明IL-1β的产生在沙门氏菌感染期间是有害的。缺乏IL-1β的小鼠（IL-1β-/-）在感染期间未能将中性粒细胞募集到肠道，这减少了组织损伤，并阻止了产生短链脂肪酸（SCFA）的共生菌的耗竭。通常在感染IL-1β-/-小鼠中支持病原体扩增的上皮细胞代谢变化，例如将能量产生从脂肪酸氧化转变为发酵，在感染的IL-1β-/-小鼠中缺失，这抑制了沙门氏菌的扩增。此外，我们发现IL-1β诱导补体过敏毒素的表达，并抑制补体灭活剂羧肽酶N（CPN1）。通过IL-1β缺失破坏这一过程，可防止沙门氏菌感染的IL-1β-/-小鼠死亡。最后，我们发现IL-1β的表达与脓毒症患者中补体受体的表达相关，但在未感染的患者和健康个体中则无此相关性。因此，沙门氏菌利用IL-1β信号传导来胜过共生微生物并建立肠道定植。此外，我们的发现确定了IL-1β信号传导与补体系统的交叉点是控制侵袭性沙门氏菌病死亡率的关键宿主因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IL-1β在肠道防御沙门氏菌感染中的作用及其机制。
- 核心机制
- 沙门氏菌感染诱导IL-1β产生，IL-1β促进中性粒细胞向肠道募集，中性粒细胞通过释放活性氧、活性氮和金属螯合剂杀伤产短链脂肪酸的共生菌，导致结肠上皮细胞代谢从β氧化转向发酵，肠道内氧气水平升高，有利于沙门氏菌扩增；同时IL-1β抑制羧肽酶N（CPN1）表达，导致补体过敏毒素水平升高，驱动败血症死亡。
- 主要证据
- IL-1β-/-小鼠在口服感染后肠道和全身器官细菌载量显著降低，组织损伤减轻，不死亡；IL-1β-/-小鼠肠道内产SCFA的梭菌未被耗竭，结肠上皮细胞仍进行β氧化并维持缺氧；万古霉素清除梭菌后消除了IL-1β-/-的保护作用；CPN1抑制剂逆转IL-1β-/-小鼠的存活优势；人类脓毒症患者中IL-1β与C3AR1表达正相关。
- 研究意义
- 揭示沙门氏菌通过操纵宿主IL-1β信号通路，利用宿主免疫反应清除共生菌、促进自身定植的机制，并确定IL-1β与补体系统的交叉点是侵袭性沙门氏菌病的关键宿主因素，为治疗提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
中性粒细胞募集检测
验证IL-1β是否影响感染过程中中性粒细胞的募集和功能。
通过RNA-seq、qPCR和免疫组化检测结肠组织中中性粒细胞相关基因、MPO和NE阳性细胞数量，以及外周血中性粒细胞比例。
肠道菌群分析
探究IL-1β缺失是否影响感染后肠道菌群组成，特别是SCFA产生菌。
16S rRNA测序分析粪便菌群，qPCR定量梭菌，并进行共居实验排除预先存在的菌群差异。
结肠上皮代谢与肠道缺氧检测
验证IL-1β是否通过影响上皮代谢和肠道氧水平促进沙门氏菌生长。
RNA-seq分析代谢通路基因表达，免疫荧光检测缺氧标志物pimonidazole，并用万古霉素清除梭菌验证因果性。
死亡率机制探索
确定IL-1β导致小鼠死亡的机制，特别是补体系统的作用。
比较不同时间点WT和IL-1β-/-小鼠结肠转录组，鉴定与血管形态相关的通路，检测补体基因表达，并用CPN1抑制剂处理。
人类脓毒症数据验证
验证IL-1β与补体受体在人类脓毒症中的相关性。
分析公开数据集（GSE134356, GSE154918, GSE134347）中全血IL-1β、C3AR1、IL1R1表达及其相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物处理 | 链霉素 | -- | -- |
| 万古霉素 | -- | -- | |
| DL-苄基琥珀酸 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 庆大霉素 | -- | -- | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Universal 试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA-seq文库构建 | NEBNext Ultra II RNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | #E7770L |
| RNA-seq | NextSeq 550测序仪 | Illumina | -- |
| RNA质量分析 | TapeStation 4200 | Agilent | -- |
| Agilent TS HS RNA 试剂盒 | Agilent | -- | |
| 文库定量 | dsDNA HS检测试剂盒 | -- | -- |
| Qubit荧光计 | Molecular Probes, Life Technologies | -- | |
| 文库质量分析 | Agilent TS D1000 试剂盒 | Agilent | -- |
| 免疫组化 | 抗中性粒细胞弹性蛋白酶抗体 | Bioss | bs-6982R |
| 抗髓过氧化物酶抗体 | Abcam | ab9535 | |
| 缺氧检测 | 哌莫硝唑盐酸盐 | Hypoxyprobe Kit | -- |
| 11.23.22.r大鼠单克隆抗体 | -- | -- | |
| 蔡司Axio imager M2显微镜 | Zeiss | -- | |
| DNA提取 | PowerSoil DNA提取试剂盒 | MoBio | -- |
| 16S文库构建 | AMPURE XP磁珠 | Beckman Coulter | -- |
| 16S文库定量 | Quant-iT PicoGreen dsDNA检测 | Thermo Fisher | -- |
| 16S测序 | MiSeq测序仪 | Illumina | -- |
| cDNA合成 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo | -- |
| qPCR | Cyber Green荧光染料 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠感染模型 | 小鼠品系（C57BL/6 WT和IL-1β-/-）、年龄（8-14周龄）、链霉素预处理（20 mg灌胃）、感染剂量（107 CFU口服SL1334） 阅读提示：Materials and methods: Mice, Salmonella infection |
| 细菌载量检测 | 器官（盲肠内容物、肠系膜淋巴结、脾脏、肝脏）的匀浆和LB琼脂平板培养条件 阅读提示：Materials and methods: Salmonella infection |
| 中性粒细胞检测 | 免疫组化抗体（抗NE和抗MPO）、染色细胞计数方法 阅读提示：Materials and methods: Histology, immunohistochemistry, and inflammation scoring |
| 肠道菌群分析 | 粪便DNA提取方法、16S rRNA V4区域扩增引物、测序平台（Illumina MiSeq） 阅读提示：Materials and methods: Microbiota profiling and analysis |
| RNA测序 | RNA提取试剂盒、文库制备试剂盒、测序平台（NextSeq 550）和数据分析方法 阅读提示：Materials and methods: RNA sequencing and analysis |
| 代谢和缺氧检测 | pimonidazole HCl剂量（1.2 mg腹腔注射）和染色抗体（11.23.22.r Rat Mab） 阅读提示：Materials and methods: Detection of hypoxia in vivo |
| CPN1抑制剂实验 | DL-Benzylsuccinic acid剂量（1.25 mg in 10% ethanol，腹腔注射，每8小时一次）、对照处理 阅读提示：Materials and methods: Carboxypeptidase-inhibitor treatment |