样本采集与形态学观察
比较繁殖季节和冬眠前输卵管形态和重量的差异
从养殖场获取54只雌蛙,分别于繁殖季节(4月)和冬眠前(9月)采集输卵管,称重并测量管径。
Investigation of seasonal changes in lipid synthesis and metabolism-related genes in the oviduct of Chinese brown frog (<em>Rana dybowskii</em>).
包含形态学、组织学、生化检测、免疫组化、qRT-PCR、转录组和代谢组学多个独立证据层级,并有功能验证。
中国林蛙输卵管组织 繁殖季节(4月)和冬眠前(9月)雌蛙
输卵管样本采集季节(繁殖季节4月,冬眠前9月) TG和FFA含量测定试剂盒及操作步骤 免疫组化抗体稀释度(1:100) qRT-PCR内参基因beta-actin 每组3个生物学重复
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较繁殖季节和冬眠前输卵管形态和重量的差异
从养殖场获取54只雌蛙,分别于繁殖季节(4月)和冬眠前(9月)采集输卵管,称重并测量管径。
观察输卵管组织结构及脂质分布
H&E染色观察组织形态,油红O染色观察脂质分布。
量化输卵管中甘油三酯和游离脂肪酸含量
使用商业试剂盒测定TG和FFA含量。
检测脂质合成和代谢相关酶在输卵管中的定位和表达
使用特定抗体对石蜡切片进行免疫组化染色,观察Dgat1、Lpl、Hsl、Fasn、Cpt1a、Acadl和Hadh的表达。
检测脂质合成和代谢相关基因的mRNA表达水平
提取RNA,反转录,使用qRT-PCR检测dgat1, fasn, hsl, lpl, cpt1a, acadl, acox, hadh的表达,以beta-actin为内参。
鉴定与脂质代谢相关的差异表达基因和通路
构建cDNA文库,进行转录组测序,进行KEGG富集分析。
鉴定与脂质代谢相关的差异代谢物
提取代谢物,使用UPLC-MS/MS进行代谢组学分析,进行KEGG通路分析。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| TG含量测定 | 甘油三酯含量测定试剂盒 | Solarbio | BC0625 |
| FFA含量测定 | 游离脂肪酸测定试剂盒 | Bioss | AK231 |
| 酶标仪 | Multiskan FC酶标仪 | Bio-Rad | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| qRT-PCR | StarScript II第一链cDNA合成试剂盒 | GenStar | -- |
| 2×SG Green qPCR预混液 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 抗DGAT1抗体 | Bioss | bs-2332R |
| 抗LPL抗体 | Abcam | ab172953 | |
| 抗HSL/LIPE抗体 | Bioss | bs-0455R | |
| 抗FASN抗体 | Bioss | bs-1498R | |
| 抗CPT1A抗体 | Bioss | bs-2047R | |
| 抗ACADL抗体 | Bioss | bs-5015R | |
| 抗HADH抗体 | Proteintech | 19828-1-AP | |
| 组织切片 | 旋转切片机 | Yidi | ES-A01-YD-315 |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1100 | |
| 显微镜 | 显微镜 | Olympus | BX51 |
| 测序 | 生物分析仪2100 | Agilent | -- |
| RNA 6000 Nano LabChip试剂盒 | Agilent | -- | |
| qRT-PCR | ABI PRISM 7500快速实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| 代谢组分析 | 超高效液相色谱系统 | Agilent | 1290 Infinity series |
| UPLC BEH amide色谱柱 | Waters | -- | |
| TripleTOF 6600质谱仪 | AB Sciex | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样品采集 | 采样季节(繁殖季节4月、冬眠前9月)、样本量(各27只) 阅读提示:Methods - Animals |
| TG和FFA含量测定 | 试剂盒型号、样品处理步骤、离心条件 阅读提示:Methods - Determination of triglycerides and free fatty acids content |
| 免疫组化 | 抗体稀释度、抗原修复条件、切片厚度 阅读提示:Methods - Immunohistochemistry |
| qRT-PCR | 引物序列、反应条件、内参基因 阅读提示:Methods - qRT-PCR and Table 1 |
| 代谢组分析 | 样品量、提取溶剂、色谱条件、质谱参数 阅读提示:Methods - Metabolite extraction and metabolome analysis |