中国林蛙输卵管脂质合成与代谢相关基因的季节性变化研究

Investigation of seasonal changes in lipid synthesis and metabolism-related genes in the oviduct of Chinese brown frog (<em>Rana dybowskii</em>).

作者信息Yankun Wang, Yuning Liu, Yawei Wang, Ao Zhang, Wenqian Xie, Haolin Zhang, Qiang Weng, Meiyu Xu
PMID38116875
发布时间2023-12
DOI10.4081/ejh.2023.3890

实验完整度

包含形态学、组织学、生化检测、免疫组化、qRT-PCR、转录组和代谢组学多个独立证据层级,并有功能验证。

主要模型

中国林蛙输卵管组织 繁殖季节(4月)和冬眠前(9月)雌蛙

重点核对

输卵管样本采集季节(繁殖季节4月,冬眠前9月) TG和FFA含量测定试剂盒及操作步骤 免疫组化抗体稀释度(1:100) qRT-PCR内参基因beta-actin 每组3个生物学重复

摘要

中国林蛙(Rana dybowskii)的一个特殊生理特征是其在冬眠前而非繁殖季节输卵管扩张。本研究旨在检测R. dybowskii输卵管在繁殖季节和冬眠前与脂质合成和代谢相关基因的表达。我们观察到繁殖季节和冬眠前输卵管重量和大小有显著变化。此外,与繁殖季节相比,冬眠前甘油三酯含量显著降低,游离脂肪酸含量显著增加。免疫组化结果显示,在繁殖季节和冬眠前,甘油三酯合酶(Dgat1)、甘油三酯水解酶(Lpl和Hsl)、脂肪酸合酶(Fasn)以及脂肪酸氧化酶(Cpt1a、Acadl和Hadh)在输卵管腺细胞和上皮细胞中的空间分布。虽然甘油三酯和游离脂肪酸合成基因(dgat1和fasn)的mRNA水平在繁殖季节和冬眠前没有显著差异,但参与甘油三酯和游离脂肪酸代谢的基因(lpl、cpt1a、acadl、acox和hadh)的mRNA水平在冬眠前显著升高。此外,R. dybowskii输卵管的转录组学和代谢组学数据证实,在繁殖季节和冬眠前,脂质代谢信号通路中富集的基因和代谢物存在差异表达。总之,这些结果表明,冬眠前脂质合成和代谢的改变可能影响输卵管的扩张大小,有助于R. dybowskii成功越冬。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
中国林蛙输卵管在冬眠前扩张的生理机制是否与脂质合成和代谢相关基因的表达变化有关?
核心机制
冬眠前输卵管通过上调脂质水解和脂肪酸氧化相关基因(lpl、cpt1a、acadl、acox、hadh)的表达,促进甘油三酯分解为游离脂肪酸并氧化供能,可能为输卵管扩张和越冬提供能量。
主要证据
冬眠前输卵管重量和管径显著增加,TG含量降低,FFA含量升高;免疫组化显示相关酶在腺细胞和上皮细胞分布;qRT-PCR显示代谢基因上调;转录组和代谢组数据支持脂质代谢通路富集。
研究意义
首次综合分析中国林蛙输卵管脂质合成与代谢,为理解两栖动物冬眠机制提供新见解,并为进一步研究脂质代谢在此过程中的复杂作用奠定基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

样本采集与形态学观察

比较繁殖季节和冬眠前输卵管形态和重量的差异

从养殖场获取54只雌蛙,分别于繁殖季节(4月)和冬眠前(9月)采集输卵管,称重并测量管径。

2

组织学染色

观察输卵管组织结构及脂质分布

H&E染色观察组织形态,油红O染色观察脂质分布。

3

TG和FFA含量测定

量化输卵管中甘油三酯和游离脂肪酸含量

使用商业试剂盒测定TG和FFA含量。

4

免疫组化

检测脂质合成和代谢相关酶在输卵管中的定位和表达

使用特定抗体对石蜡切片进行免疫组化染色,观察Dgat1、Lpl、Hsl、Fasn、Cpt1a、Acadl和Hadh的表达。

5

qRT-PCR

检测脂质合成和代谢相关基因的mRNA表达水平

提取RNA,反转录,使用qRT-PCR检测dgat1, fasn, hsl, lpl, cpt1a, acadl, acox, hadh的表达,以beta-actin为内参。

6

转录组分析

鉴定与脂质代谢相关的差异表达基因和通路

构建cDNA文库,进行转录组测序,进行KEGG富集分析。

7

代谢组分析

鉴定与脂质代谢相关的差异代谢物

提取代谢物,使用UPLC-MS/MS进行代谢组学分析,进行KEGG通路分析。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
甘油三酯含量测定试剂盒SolarbioBC0625
游离脂肪酸测定试剂盒BiossAK231
Multiskan FC酶标仪Bio-Rad--
Trizol试剂Invitrogen--
StarScript II第一链cDNA合成试剂盒GenStar--
2×SG Green qPCR预混液----
抗DGAT1抗体Biossbs-2332R
抗LPL抗体Abcamab172953
抗HSL/LIPE抗体Biossbs-0455R
抗FASN抗体Biossbs-1498R
抗CPT1A抗体Biossbs-2047R
抗ACADL抗体Biossbs-5015R
抗HADH抗体Proteintech19828-1-AP
旋转切片机YidiES-A01-YD-315
冷冻切片机LeicaCM1100
显微镜OlympusBX51
生物分析仪2100Agilent--
RNA 6000 Nano LabChip试剂盒Agilent--
ABI PRISM 7500快速实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--
超高效液相色谱系统Agilent1290 Infinity series
UPLC BEH amide色谱柱Waters--
TripleTOF 6600质谱仪AB Sciex--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样品采集
采样季节(繁殖季节4月、冬眠前9月)、样本量(各27只)
阅读提示:Methods - Animals
TG和FFA含量测定
试剂盒型号、样品处理步骤、离心条件
阅读提示:Methods - Determination of triglycerides and free fatty acids content
免疫组化
抗体稀释度、抗原修复条件、切片厚度
阅读提示:Methods - Immunohistochemistry
qRT-PCR
引物序列、反应条件、内参基因
阅读提示:Methods - qRT-PCR and Table 1
代谢组分析
样品量、提取溶剂、色谱条件、质谱参数
阅读提示:Methods - Metabolite extraction and metabolome analysis