脐带间充质干细胞通过调控Hedgehog通路抑制支气管上皮细胞炎症

Umbilical cord mesenchymal stem cells inhibited inflammation of bronchial epithelial cells by regulating Hedgehog pathway.

作者信息Qiong Lin, Tianxing Yu, Xiaohua Li, Xin Lin, Yong Fan, Liyu Xu
PMID38085254
发布时间2023-12-12
DOI10.4081/ejh.2023.3908

实验完整度

包含体外细胞模型、药物干预和共培养实验,进行增殖、凋亡、炎症因子和蛋白表达检测,但缺乏动物模型和患者样本验证。

主要模型

人支气管上皮细胞系BEAS-2B 脐带间充质干细胞(UCMSCs)

重点核对

细胞分组:对照组、TGF-β1诱导的模型组、KAAD-环巴胺处理组、UCMSCs共培养组 TGF-β1浓度:10 ng/mL,处理时间:7 h KAAD-环巴胺浓度:100 nM 共培养系统:Transwell共培养系统 实验重复:所有实验重复三次

摘要

本研究旨在探讨脐带间充质干细胞(UCMSCs)在调节支气管上皮细胞炎症中的作用及机制。使用转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人支气管上皮细胞炎症。通过CCK8检测细胞增殖,通过Annexin V和碘化丙啶双重染色检测细胞凋亡。通过免疫荧光检测E-钙黏蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),通过ELISA检测培养上清液中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)。通过Western blot分析检测E-钙黏蛋白、α-SMA、Sonic hedgehog(Shh)、Gli1和Snail的表达。与对照组相比,TGF-β1处理的支气管上皮细胞增殖显著降低,凋亡增加,TNF-α和IL-6分泌增加,α-SMA、Shh、Gli1和Snail表达增加,E-钙黏蛋白表达降低。然而,与UCMSCs共培养可抑制TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞增殖、凋亡、TNF-α和IL-6分泌的变化以及Hedgehog通路的激活。总之,UCMSCs通过调节Hedgehog通路对TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞炎症具有保护作用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
本研究旨在探讨UCMSCs是否通过调控Hedgehog通路抑制TGF-β1诱导的支气管上皮细胞炎症。
核心机制
UCMSCs通过抑制Hedgehog通路的激活,降低Shh、Gli1和Snail的表达,从而减轻支气管上皮细胞的炎症反应和上皮-间质转化过程。
主要证据
体外实验中,TGF-β1诱导的支气管上皮细胞炎症模型显示,UCMSCs共培养可恢复细胞增殖、减少凋亡、降低TNF-α和IL-6的分泌,并调节E-钙黏蛋白和α-SMA的表达,同时抑制Shh、Gli1和Snail的表达。
研究意义
本研究首次揭示Hedgehog信号通路在介导UCMSCs对TGF-β诱导的支气管上皮细胞炎症的作用中发挥重要作用,提示UCMSCs在哮喘治疗中的潜在应用价值。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

细胞鉴定

验证人支气管上皮细胞系BEAS-2B和UCMSCs的特征,确保实验模型正确。

对BEAS-2B细胞进行PCK免疫荧光染色鉴定;对UCMSCs进行CD29、CD90和CD44的流式细胞术鉴定。

2

建立哮喘炎症细胞模型及干预

建立TGF-β1诱导的支气管上皮细胞炎症模型,并评估Hedgehog通路抑制剂和UCMSCs共培养的干预效果。

将BEAS-2B细胞分为对照组、模型组、KAAD-环巴胺组和UCMSCs组。模型组用TGF-β1处理7小时;抑制剂组另加KAAD-环巴胺;UCMSCs组与UCMSCs在Transwell系统中共培养。

3

检测细胞增殖和凋亡

评估TGF-β1及干预对支气管上皮细胞增殖和凋亡的影响。

使用CCK8试剂盒检测细胞增殖;使用Annexin V-FITC和PI双染结合流式细胞术检测细胞凋亡。

4

检测炎症因子分泌

评估TGF-β1及干预对支气管上皮细胞炎症因子分泌的影响。

收集细胞培养上清液,通过ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-6的含量。

5

检测上皮-间质转化标志物及Hedgehog通路蛋白表达

验证TGF-β1及干预对E-钙黏蛋白、α-SMA和Hedgehog通路相关蛋白(Shh、Gli1、Snail)表达的影响。

通过免疫荧光和Western blot检测E-钙黏蛋白、α-SMA、Shh、Gli1和Snail的表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基Gibco--
胎牛血清Gibco--
泛细胞角蛋白抗体Biossbs-5352r
Cy3二抗ABclonalAS007
DAPISigma-Aldrich--
CD29 PE抗体Biolegend303003
CD90 FITC抗体Biolegend328108
CD44 PE/Cy7抗体Invitrogen25-0441-82
NovoCyte 2060R流式细胞仪Eisen Bio--
转化生长因子-β1MCEHY-P7118
KAAD-环巴胺MCEHY-100535
CCK8试剂Dojindo--
Annexin V-FITC和PI试剂盒Multi SciencesAP101-100-kit
BD LSRII流式细胞仪BD Biosciences--
E-钙黏蛋白抗体Affinityaf0131
α-SMA抗体Cell Signaling Technology19245
TNF-α ELISA试剂盒Jiangsu Enzyme Free Industry Co., Ltd.MM-0122H2
IL-6 ELISA试剂盒Jiangsu Enzyme Free Industry Co., Ltd.MM-0049H2
BCA蛋白定量试剂盒ElabscienceE-BC-K318-M
E-钙黏蛋白抗体Santa Cruz BiotechnologySc-8426
α-SMA抗体Abcamab124964
Shh抗体Proteintech20697-1-AP
Gli1抗体ABclonalA8387
Snail抗体AffinityAF6032

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞模型建立
细胞系BEAS-2B;TGF-β1浓度10 ng/mL,处理时间7小时
阅读提示:见Materials and Methods中的Cell treatment部分
药物干预
KAAD-环巴胺浓度100 nM
阅读提示:见Materials and Methods中的Cell treatment部分
共培养
Transwell共培养系统
阅读提示:见Materials and Methods中的Cell treatment部分
细胞增殖检测
CCK8试剂孵育2小时,检测450 nm吸光度
阅读提示:见Materials and Methods中的CCK8 assay部分
细胞凋亡检测
Annexin V-FITC和PI染色10分钟,流式检测记录1×10^5个事件
阅读提示:见Materials and Methods中的Flow cytometry analysis of apoptosis部分
炎症因子检测
收集细胞培养上清液,使用ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-6
阅读提示:见Materials and Methods中的ELISA部分
蛋白表达检测
一抗稀释度和二抗稀释度
阅读提示:见Materials and Methods中的Western blot analysis部分
统计方法
单因素方差分析,p<0.05为差异显著
阅读提示:见Materials and Methods中的Statistical analysis部分