细胞鉴定
验证人支气管上皮细胞系BEAS-2B和UCMSCs的特征,确保实验模型正确。
对BEAS-2B细胞进行PCK免疫荧光染色鉴定;对UCMSCs进行CD29、CD90和CD44的流式细胞术鉴定。
Umbilical cord mesenchymal stem cells inhibited inflammation of bronchial epithelial cells by regulating Hedgehog pathway.
包含体外细胞模型、药物干预和共培养实验,进行增殖、凋亡、炎症因子和蛋白表达检测,但缺乏动物模型和患者样本验证。
人支气管上皮细胞系BEAS-2B 脐带间充质干细胞(UCMSCs)
细胞分组:对照组、TGF-β1诱导的模型组、KAAD-环巴胺处理组、UCMSCs共培养组 TGF-β1浓度:10 ng/mL,处理时间:7 h KAAD-环巴胺浓度:100 nM 共培养系统:Transwell共培养系统 实验重复:所有实验重复三次
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证人支气管上皮细胞系BEAS-2B和UCMSCs的特征,确保实验模型正确。
对BEAS-2B细胞进行PCK免疫荧光染色鉴定;对UCMSCs进行CD29、CD90和CD44的流式细胞术鉴定。
建立TGF-β1诱导的支气管上皮细胞炎症模型,并评估Hedgehog通路抑制剂和UCMSCs共培养的干预效果。
将BEAS-2B细胞分为对照组、模型组、KAAD-环巴胺组和UCMSCs组。模型组用TGF-β1处理7小时;抑制剂组另加KAAD-环巴胺;UCMSCs组与UCMSCs在Transwell系统中共培养。
评估TGF-β1及干预对支气管上皮细胞增殖和凋亡的影响。
使用CCK8试剂盒检测细胞增殖;使用Annexin V-FITC和PI双染结合流式细胞术检测细胞凋亡。
评估TGF-β1及干预对支气管上皮细胞炎症因子分泌的影响。
收集细胞培养上清液,通过ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-6的含量。
验证TGF-β1及干预对E-钙黏蛋白、α-SMA和Hedgehog通路相关蛋白(Shh、Gli1、Snail)表达的影响。
通过免疫荧光和Western blot检测E-钙黏蛋白、α-SMA、Shh、Gli1和Snail的表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞鉴定 | 泛细胞角蛋白抗体 | Bioss | bs-5352r |
| Cy3二抗 | ABclonal | AS007 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| CD29 PE抗体 | Biolegend | 303003 | |
| CD90 FITC抗体 | Biolegend | 328108 | |
| CD44 PE/Cy7抗体 | Invitrogen | 25-0441-82 | |
| NovoCyte 2060R流式细胞仪 | Eisen Bio | -- | |
| 药物处理 | 转化生长因子-β1 | MCE | HY-P7118 |
| KAAD-环巴胺 | MCE | HY-100535 | |
| CCK8检测 | CCK8试剂 | Dojindo | -- |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC和PI试剂盒 | Multi Sciences | AP101-100-kit |
| BD LSRII流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 免疫荧光 | E-钙黏蛋白抗体 | Affinity | af0131 |
| α-SMA抗体 | Cell Signaling Technology | 19245 | |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | Jiangsu Enzyme Free Industry Co., Ltd. | MM-0122H2 |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Jiangsu Enzyme Free Industry Co., Ltd. | MM-0049H2 | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Elabscience | E-BC-K318-M |
| E-钙黏蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-8426 | |
| α-SMA抗体 | Abcam | ab124964 | |
| Shh抗体 | Proteintech | 20697-1-AP | |
| Gli1抗体 | ABclonal | A8387 | |
| Snail抗体 | Affinity | AF6032 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型建立 | 细胞系BEAS-2B;TGF-β1浓度10 ng/mL,处理时间7小时 阅读提示:见Materials and Methods中的Cell treatment部分 |
| 药物干预 | KAAD-环巴胺浓度100 nM 阅读提示:见Materials and Methods中的Cell treatment部分 |
| 共培养 | Transwell共培养系统 阅读提示:见Materials and Methods中的Cell treatment部分 |
| 细胞增殖检测 | CCK8试剂孵育2小时,检测450 nm吸光度 阅读提示:见Materials and Methods中的CCK8 assay部分 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC和PI染色10分钟,流式检测记录1×10^5个事件 阅读提示:见Materials and Methods中的Flow cytometry analysis of apoptosis部分 |
| 炎症因子检测 | 收集细胞培养上清液,使用ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-6 阅读提示:见Materials and Methods中的ELISA部分 |
| 蛋白表达检测 | 一抗稀释度和二抗稀释度 阅读提示:见Materials and Methods中的Western blot analysis部分 |
| 统计方法 | 单因素方差分析,p<0.05为差异显著 阅读提示:见Materials and Methods中的Statistical analysis部分 |