瘢痕疙瘩组织和正常皮肤中FGFR1表达检测
验证FGFR1在瘢痕疙瘩中的表达是否升高，以支持其作为治疗靶点。
对8例瘢痕疙瘩组织和6例正常皮肤进行免疫荧光染色，检测FGFR1和collagen I的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Derazantinib通过FGFR信号抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物活性
Derazantinib Inhibits the Bioactivity of Keloid Fibroblasts via FGFR Signaling.
实验完整度
高包含体外细胞实验（CCK-8、迁移、侵袭、免疫荧光、RT-PCR、Western blot）和体内异种移植模型验证，并涉及患者样本（瘢痕疙瘩和正常皮肤）的免疫荧光检测，具有多个独立证据层级和功能及机制验证。
主要模型
人瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFs） 人正常皮肤成纤维细胞（Fbs） BALB/C无胸腺裸鼠异种移植模型
重点核对
FGFR1在瘢痕疙瘩组织中的表达高于正常皮肤（免疫荧光） derazantinib处理浓度（0.16-5 μmol/L）及处理时间（48h）对细胞活力、迁移、侵袭的影响 derazantinib对KFs中PAI-1、α-SMA、collagen I等纤维化标志物的抑制作用 裸鼠模型中derazantinib注射剂量（1 mg/mL和2 mg/mL）及对植入瘢痕重量和胶原的影响
摘要
瘢痕疙瘩是常见的良性皮肤病理性纤维增生性疾病，难以治愈且易复发。研究表明，成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）在肝硬化、特发性肺纤维化（IPF）等病理性纤维增生疾病中表达增强，提示FGFR1通路具有治疗瘢痕疙瘩的潜力。Derazantinib是一种选择性FGFR抑制剂，在体外和体内模型中具有抗增殖活性。本研究确定了derazantinib对人瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFs）的作用。采用细胞活力测定、迁移测定、侵袭测定、免疫荧光染色、定量聚合酶链反应、Western blot分析、HE染色、Masson染色和免疫组织化学分析来分析KFs和瘢痕疙瘩异种移植物。在本研究中，我们发现derazantinib在体外抑制了KFs的增殖、迁移、侵袭和胶原蛋白产生。与胶原沉积和组织纤维化密切相关的纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的转录和表达被显著抑制。此外，derazantinib抑制了FGFR1和PAI-1的表达，并减轻了异种移植小鼠模型中植入瘢痕疙瘩的重量。这些发现表明，derazantinib可能通过FGFR信号传导成为治疗瘢痕疙瘩的有效疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Derazantinib能否通过FGFR信号传导抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物活性？
- 核心机制
- Derazantinib通过抑制FGFR1及其下游AKT和ERK信号通路，下调PAI-1、α-SMA和collagen I的表达，从而抑制KFs的增殖、迁移、侵袭和胶原产生。
- 主要证据
- 体外实验显示derazantinib抑制KFs增殖、迁移、侵袭，并降低PAI-1、α-SMA、collagen I的mRNA和蛋白水平；体内裸鼠模型显示derazantinib局部注射减轻了植入瘢痕疙瘩的重量，并减少胶原和微血管。
- 研究意义
- 作者提出derazantinib可能通过FGFR信号传导成为治疗瘢痕疙瘩的有效策略，值得进一步临床试验。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Derazantinib对KFs增殖和凋亡的影响
评估derazantinib是否抑制KFs的活力并诱导凋亡，并比较对正常成纤维细胞的影响。
通过CCK-8法测定不同浓度derazantinib处理后KFs的活力，并用Ki67和Calcein AM/PI染色评估增殖和凋亡。
Derazantinib对KFs迁移和侵袭的影响
检测derazantinib是否抑制KFs的迁移和侵袭能力。
通过划痕实验评估迁移，Transwell实验评估侵袭。
Derazantinib对KFs纤维化标志物和相关信号通路的影响
探究derazantinib抑制KFs生物活性的分子机制。
通过RT-PCR和Western blot检测纤维化相关基因和蛋白表达，以及AKT/ERK信号通路的变化。
Derazantinib在裸鼠模型中的体内疗效评估
评估derazantinib局部注射对移植瘢痕组织的治疗效果。
将人瘢痕组织移植到裸鼠皮下，分别注射生理盐水、不同浓度derazantinib和倍他米松，4周后取出组织测量重量并进行组织学分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
检测细胞活力与增殖
检测细胞迁移和侵袭
检测基因表达
检测蛋白表达
评估体内疗效
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | Derazantinib | MCE | -- |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM） | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞消化 | IV型胶原酶 | Biofroxx | -- |
| 透明质酸酶 | Biofroxx | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Laboratories | -- |
| 细胞凋亡检测 | Calcein AM和碘化丙啶检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| qPCR | SYBR Green PCR试剂盒 | Servicebio | -- |
| 实时热循环仪 | Bio-Rad | CFX96 | |
| 免疫荧光 | DAPI | Thermo Fisher | -- |
| FGFR-1抗体 | Proteintech | 60325-1-Ig | |
| I型胶原抗体 | CST | 66948 | |
| Ki-67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| PAI-1抗体 | Proteintech | 13801-1-AP | |
| α-SMA抗体 | Affinity | AF1032 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | Abcam | ab6789 | |
| 抗小鼠IgG Alexa Fluor 488 | CST | -- | |
| 抗兔IgG Alexa Fluor 488 | CST | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| GAPDH抗体 | Servicebio | GB11002 | |
| PI3K抗体 | Affinity | AF5112 | |
| p-AKT抗体 | Affinity | AF0016 | |
| AKT抗体 | Bioss | BS0115R | |
| p-ERK抗体 | Affinity | AF1015 | |
| ERK抗体 | Affinity | AF0155 | |
| TGF-β抗体 | Bosterbio | BA0290 | |
| Smad抗体 | Affinity | 6367 | |
| p-Smad抗体 | Affinity | 3367 | |
| HRP标记的二抗 | Abcam | ab205718 | |
| 增强化学发光检测系统 | GE | AI800 | |
| 动物实验 | 倍他米松 | -- | -- |
| 组织学染色 | Masson染色试剂盒 | Servicebio | -- |
| 显微镜 | 荧光显微镜 | Olympus | -- |
| 酶标仪 | Thermo Fisher | -- | |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
| Image-Pro Plus | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 免疫荧光检测瘢痕组织和正常皮肤 | 样本来源：瘢痕组织来自8例未治疗患者（前胸部），正常皮肤来自6例乳房缩小术患者；抗体稀释比；显微镜型号 阅读提示：见2.1节和3.1节 |
| 细胞培养和药物处理 | KFs传代次数（P3-P6）；细胞密度（CCK-8：1.0×10^3细胞/孔；划痕：1.0×10^4细胞/孔；侵袭：6×10^4细胞）；derazantinib浓度和处理时间；DMSO最终浓度<0.1% 阅读提示：见2.2节、2.3节、2.4节、2.5节、2.6节 |
| 细胞功能检测 | 划痕实验：细胞融合度>90%，处理时间（0h,24h,48h）；transwell：处理浓度2.5μmol/L，处理48小时；凋亡染色：浓度2.5μmol/L处理48小时 阅读提示：见2.5节、2.6节、2.7节 |
| 分子表达检测 | RT-qPCR：处理浓度（0,1.25,2.5,5μmol/L）处理48小时，内参GAPDH，引物序列见表1；Western blot：处理浓度2.5μmol/L处理48小时，抗体列表 阅读提示：见2.9节、2.10节、表1 |
| 裸鼠异种移植模型 | 小鼠品系和数量（BALB/C雌性无胸腺裸鼠，12只，8周龄，20-22g）；移植组织大小（5mm×5mm×5mm）；注射方案（0.1mL，浓度：生理盐水、2mg/mL DZB、1mg/mL DZB、2mg/mL BMT，注射时间1周和2周）；取材时间（4周）；检测指标（HE、Masson、免疫荧光） 阅读提示：见2.11节和3.5节 |