鉴定P. gingivalis感染的蛋白质组变化
探索P. gingivalis感染对结肠癌细胞蛋白质表达谱的影响，识别关键蛋白。
用P. gingivalis（MOI=100）处理HCT116细胞48小时，进行无标记定量质谱分析，比较感染组与对照组蛋白质表达差异。
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牙龈卟啉单胞菌诱导UCHL3促进结肠癌进展
Porphyromonas gingivalis induced UCHL3 to promote colon cancer progression.
实验完整度
高包含体外功能实验（CCK8、集落形成、EDU、划痕）、体内皮下瘤模型、蛋白质组学和IP-MS机制验证，证据层级完整。
主要模型
HCT116细胞系 MC38细胞系 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型 结肠癌及癌前病变组织样本
重点核对
P. gingivalis感染剂量MOI=100及感染时间（24h或48h） UCHL3敲低细胞系的构建及敲低效率验证 体内实验中MC38细胞注射量（5×10^6）和P. gingivalis注射剂量（10^6 CFU） GNG12过表达质粒及转染效果验证 统计方法（t检验或单因素方差分析）及重复次数（至少三次）
摘要
牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）是一种革兰阴性口腔厌氧菌，已被证明可促进结肠肿瘤的定植和进展，但其潜在机制仍有待阐明。在本研究中，我们通过无标记定量蛋白质组学鉴定了P. gingivalis感染HCT116细胞后改变的蛋白质组谱，并发现去泛素化酶UCHL3是响应P. gingivalis感染的关键蛋白。通过CCK8、集落形成、划痕愈合实验以及体内皮下肿瘤小鼠模型，我们证明了P. gingivalis可以促进结肠癌的增殖和迁移，而UCHL3敲低则抑制了这一过程。通过免疫沉淀-质谱（IP-MS），我们确定了GNG12为UCHL3的相互作用蛋白。当UCHL3敲除时，GNG12的蛋白水平显著降低。因此，我们提出GNG12是UCHL3的底物蛋白。此外，我们证明了GNG12的过表达可以恢复由UCHL3敲低引起的肿瘤抑制作用，并且UCHL3-GNG12轴通过NF-κB信号通路促进结肠癌进展。总体而言，本研究揭示了P. gingivalis感染上调UCHL3并稳定其底物蛋白GNG12，从而激活NF-κB信号通路以促进结肠癌进展。我们的研究表明UCHL3是P. gingivalis感染的结肠癌的潜在生物标志物和治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- P. gingivalis感染如何通过蛋白质水平变化促进结肠癌进展？
- 核心机制
- P. gingivalis感染上调UCHL3，UCHL3与GNG12相互作用并稳定GNG12，进而激活NF-κB信号通路，促进结肠癌进展。
- 主要证据
- 蛋白质组学发现UCHL3显著上调；体外功能实验（CCK8、集落形成、EDU、划痕）显示UCHL3敲低抑制增殖迁移；IP-MS验证UCHL3与GNG12结合，且UCHL3敲低降低GNG12蛋白水平；GNG12过表达可部分回复UCHL3敲低效应；动物实验证实Uchl3敲低抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示P. gingivalis感染促进结肠癌的分子机制，提示UCHL3可作为P. gingivalis阳性结肠癌的潜在生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证P. gingivalis对UCHL3表达的影响
验证P. gingivalis感染是否上调UCHL3，并探究其与感染的相关性。
用不同剂量和时间梯度处理HCT116细胞，检测UCHL3的mRNA和蛋白水平；检测结肠癌组织中UCHL3表达与P. gingivalis感染的关系。
评估UCHL3在P. gingivalis促进结肠癌细胞增殖和迁移中的作用
探究UCHL3是否介导P. gingivalis对结肠癌细胞增殖和迁移的促进作用。
构建UCHL3敲低HCT116细胞系，通过CCK8、集落形成、EDU和划痕实验检测P. gingivalis处理后细胞增殖和迁移能力的变化。
动物水平验证Uchl3对P. gingivalis促进肿瘤生长的必要性
验证Uchl3在体内对P. gingivalis促进结肠癌生长的作用。
构建Uchl3敲低的MC38细胞，皮下注射至裸鼠，待肿瘤生长后注射P. gingivalis，比较肿瘤大小和重量。
鉴定UCHL3的相互作用蛋白并验证底物
寻找UCHL3相互作用蛋白，验证GNG12是否为UCHL3的底物。
在HCT116细胞中表达FLAG-UCHL3，免疫沉淀后质谱鉴定相互作用蛋白；通过共转染、免疫共沉淀和Western blot验证UCHL3与GNG12的相互作用；敲低UCHL3检测GNG12蛋白和mRNA水平变化。
验证UCHL3-GNG12轴对结肠癌进展的作用
探究GNG12是否介导UCHL3促进结肠癌进展的作用，并初探NF-κB通路参与情况。
在UCHL3敲低细胞中过表达GNG12，观察细胞增殖和迁移是否恢复；检测NF-κB通路下游基因PD-L1的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibico | 11965118 |
| 细菌培养 | 脑心浸液肉汤 | OXOID | CM1032B |
| 酵母提取物 | OXOID | LP0021T | |
| L-半胱氨酸 | Merck | 168149 | |
| Western blot | UCHL3多克隆抗体 | Proteintech | 12384-1-AP |
| Gγ12抗体 | Bioss | bs-13242R | |
| β-actin单克隆抗体 | Sigma | A2228 | |
| Flag M2单克隆抗体 | Sigma | F3165 | |
| HA标签兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 山羊抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗 | Thermo Fisher | A32731 | |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗 | Thermo Fisher | A32723 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Vazyme | R401-01 |
| qPCR | qPCR第一链cDNA合成预混液试剂盒 | Yeasen | 11141ES60 |
| SYBR Green预混液（无Rox） | Yeasen | 11201ES03 | |
| 质粒构建 | EcoR1限制性内切酶 | Biolabs | R3101T |
| Not1限制性内切酶 | Biolabs | R3189S | |
| T4 DNA连接酶 | Thermo Fisher | EL0016 | |
| BamH1限制性内切酶 | Biolabs | R3136M | |
| 免疫共沉淀 | Anti-Flag磁珠 | Smart-lifesciences | SA042005 |
| Anti-HA亲和磁珠 | Smart-lifesciences | SA068005 | |
| 细胞增殖检测 | CCK8试剂盒 | Beyotime | C0037 |
| BeyoClick™ EDU-488细胞增殖检测试剂盒 | Beyotime | C0071L |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| P. gingivalis培养 | 培养条件：厌氧、37℃、200 rpm；培养基成分和OD600约0.4 阅读提示：Materials and methods - Bacteria culture |
| 细胞处理 | P. gingivalis感染剂量（MOI=100）和处理时间（24h或48h），细胞系 阅读提示：Materials and methods - Cell culture and treatment；Results 相应图注 |
| UCHL3敲低细胞构建 | shRNA序列、载体、筛选浓度（1 μg/ml或2 mg/mL？）和时间（2周） 阅读提示：Materials and methods - Lentivirus package and stable cell line construction；Figure 3A |
| 动物模型 | 动物品系、周龄、性别（BALB/c裸鼠，4-6周龄），细胞注射量（5×10^6）和部位，P. gingivalis注射剂量（10^6 CFU）和频率（每周2次），处理时间 阅读提示：Materials and methods - Animals and subcutaneous tumor mouse model；Figure 4B |
| 功能验证 | CCK8实验细胞密度和检测时间；集落形成实验细胞数和培养时间（14天）；EDU实验细胞密度和处理时间；划痕实验细胞密度和处理时间 阅读提示：Materials and methods - CCK8 assay, Colony formation, EDU assay, Wound healing assay |