mRNA输出蛋白ZC3H11A在HCMV感染和泛癌中的分析

Analysis of the mRNA export protein ZC3H11A in HCMV infection and pan-cancer.

作者信息Jiawen Li, Min Song, Zhen Liu, Fulong Nan, Bin Wang, Dongmeng Qian, Ming Hu
PMID38033582
发布时间2023-11-15
DOI10.3389/fmicb.2023.1296725

实验完整度

包含细胞实验(HCMV感染胶质瘤细胞系U87)和多组学数据库分析,但缺乏体内功能验证和机制实验。

主要模型

U87胶质瘤细胞系 TCGA泛癌队列 CPTAC泛癌队列

重点核对

HCMV感染U87细胞,MOI=1,2天 qRT-PCR验证ZC3 mRNA表达 Western blot验证ZC3蛋白表达 TCGA和CPTAC数据分析方法

摘要

背景:我们之前已报道人巨细胞病毒(HCMV)感染可促进胶质瘤的进展。在这里,我们通过HCMV感染后的高通量测序发现了一种应激诱导的核蛋白ZC3H11A(ZC3),我们研究组最近报道了其在应激条件下调节mRNA输出的作用。此外,对ZC3在泛癌中的全面分析以及ZC3的组学数据尚未进行。方法:通过RNA测序评估HCMV感染后胶质瘤细胞的转录组。通过qRT-PCR和Western-blot验证并测量HCMV感染后ZC3的mRNA和蛋白水平。利用R包分析并可视化ZC3在泛癌中的RNA测序和蛋白表达信息。利用HPA的IHC图像评估ZC3蛋白的定位。通过CPTAC数据门户提取不同癌症中ZC3的蛋白质组学和转录组学数据,并用Python脚本进行比较。利用cBioPortal、TCGA和TIMER2数据库分析ZC3在泛癌中的基因改变、生存预后、免疫浸润。利用STRING、GEPIA2和TCGA揭示蛋白相互作用网络。结果:HCMV感染后mRNA加工途径的基因上调,并验证了ZC3在mRNA和蛋白水平的表达。我们还发现,ZC3的状态在癌症中普遍处于高水平,尽管在不同癌症类型中有所差异。肿瘤细胞中ZC3蛋白定位于细胞核,而在正常细胞中主要存在于胞质/膜。然而,从某些癌症类型的ZC3蛋白质组学和转录组学数据来看,ZC3蛋白的增加并未伴随mRNA水平的显著升高。此外,我们的分析表明,ZC3表达升高主要与大多数癌症的不良预后相关,但仍因癌症类型而异。我们的注释分析表明,ZC3相关蛋白主要参与mRNA加工簇。结论:我们证明了ZC3在胶质瘤中受HCMV感染的显著影响。此外,我们在TCGA泛癌队列中鉴定了一组与ZC3H11A表达模式相似的基因,暗示ZC3H11A在mRNA加工中的潜在功能作用。我们的研究为新的mRNA输出蛋白ZC3在HCMV感染和泛癌进展中的作用提供了有价值的见解。这些结果为我们后续研究ZC3在病毒感染肿瘤中的调控机制奠定了基础。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
ZC3在HCMV感染和泛癌中的表达模式及其潜在功能。
核心机制
ZC3参与mRNA加工、剪接和输出,可能通过TREX复合体影响肿瘤进展。
主要证据
HCMV感染上调U87细胞中ZC3表达;泛癌转录组和蛋白质组分析显示ZC3高表达与不良预后相关;ZC3相关蛋白富集于mRNA加工簇。
研究意义
为ZC3在病毒感染和肿瘤进展中的作用提供新见解,为癌症诊断和治疗提供潜在靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

HCMV感染对胶质瘤细胞转录组的影响

鉴定HCMV感染后显著变化的基因和通路。

使用HCMV AD169感染U87细胞(MOI=1,2天),提取RNA进行RNA-seq,比较感染组和模拟感染组的基因表达差异。

2

验证ZC3在HCMV感染后的表达

验证RNA-seq结果中ZC3 mRNA和蛋白水平的上调。

通过qRT-PCR和Western blot检测HCMV感染后ZC3 mRNA和蛋白表达水平。

3

泛癌表达和定位分析

分析ZC3在泛癌中的mRNA和蛋白表达模式及亚细胞定位。

利用TCGA RNA-seq数据(HTSeq-FPKM,转换为TPM)分析ZC3 mRNA表达;利用CPTAC蛋白质组学数据分析蛋白表达;利用HPA IHC图像评估蛋白定位。

4

蛋白质组学和转录组学相关性分析

比较ZC3蛋白和mRNA表达的一致性。

使用Python脚本从CPTAC数据门户提取泛癌蛋白质组学和转录组学数据,并绘制散点图。

5

磷酸化分析

探究ZC3蛋白的磷酸化状态在肿瘤中的变化。

利用CPTAC磷酸化蛋白质组学数据,比较原发肿瘤和正常组织中ZC3特异性磷酸化位点的水平。

6

遗传改变分析

分析ZC3基因在泛癌中的遗传改变频率和类型及其对预后的影响。

使用cBioPortal查询TCGA PanCancer Atlas中ZC3的遗传改变,包括突变、拷贝数改变,并分析其与生存的相关性。

7

生存预后分析

评估ZC3表达水平与泛癌患者生存预后的关系。

利用GEPIA2的Survival Map和Survival Analysis模块,分析ZC3高表达组和低表达组的总生存期和无病生存期。

8

免疫浸润分析

评估ZC3表达与免疫细胞浸润的相关性。

使用TIMER2的Immune-Gene模块,计算ZC3表达与CAFs、NK细胞、CD8+ T细胞浸润的相关性,使用多种算法。

9

蛋白相互作用和功能富集分析

揭示ZC3相关蛋白的相互作用网络和功能富集。

使用STRING数据库构建蛋白相互作用网络,使用GEPIA2获取ZC3共表达基因,进行GO和KEGG富集分析。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
MEM培养基----
TRIzol试剂Invitrogen--
Illumina TruSeq链特异性mRNA-seq文库制备试剂盒Illumina--
NextSeq 500测序平台Illumina--
第一链cDNA合成试剂盒MBI Fermentas--
SYBR Green 预混液----
Bio-Rad iCycler IQ5系统Bio-Rad--
RIPA裂解液(含PMSF)----
PVDF膜Merck Millipore--
ZC3抗体 (ab99930)Abcamab99930
HCMV IE抗体 (ab53495)Abcamab53495
β-actin抗体 (bs-10966R)Biossbs-10966R
GraphPad Prism--version 8

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
HCMV感染
U87细胞系,HCMV AD169,MOI=1,感染时间2天,血清饥饿处理
阅读提示:Methods: Cell culture and virus infection
qRT-PCR验证
引物序列(ZC3、HCMV UL122、β-actin),cDNA合成试剂盒,SYBR Green Master mix,Bio-Rad iCycler IQ5
阅读提示:Methods: Reverse transcription and quantitative real-time PCR
Western blot验证
蛋白提取(RIPA+PMSF),PVDF膜,一抗浓度(ZC3 1:1000, HCMV IE 1:1000, β-actin 1:2000)
阅读提示:Methods: Western blot analysis
泛癌表达分析
TCGA RNA-seq数据(HTSeq-FPKM转换为TPM),log2转换,样本类型(肿瘤与正常)
阅读提示:Methods: An analysis of ZC3 expression across pan-cancer
预后分析
GEPIA2的cutoff-high/low (50%),log-rank检验,OS和DFS
阅读提示:Methods: Survival prognosis analysis