DPCs分离与鉴定
获取高纯度DPCs并验证SOX18表达
从3日龄湖羊皮肤分离毛囊，培养获得DPCs；免疫荧光检测标记基因（PDGFRA, VCAN, α-SMA, Vimentin）和SOX18表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
SOX18通过Wnt/β-Catenin信号通路促进真皮乳头细胞增殖
SOX18 Promotes the Proliferation of Dermal Papilla Cells via the Wnt/β-Catenin Signaling Pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（过表达/敲低）、RNA-seq、通路验证（TOP/FOP-flash、qRT-PCR、WB）及挽救实验，多层级验证功能与机制。
主要模型
湖羊真皮乳头细胞（DPCs） 湖羊皮肤组织
重点核对
SOX18过表达与敲低对DPC增殖的影响 siRNA-2537（30 nM）有效敲低SOX18 Wnt/β-catenin通路活性（TOP/FOP-flash） Wnt通路抑制剂ICG001（30 µM）处理 RNA-seq差异基因筛选（Fold Change ≥2, FDR<0.05）
摘要
SRY盒转录因子18（SOX18）已知在人类和小鼠毛囊（HF）的生长和发育中发挥关键作用。然而，SOX18对绵羊毛囊的具体影响仍 largely 未知。在我们先前的研究中，我们观察到SOX18在绵羊毛囊的真皮乳头细胞（DPCs）中特异性表达，促使我们研究其在绵羊毛囊生长中的潜在作用。在本研究中，我们旨在检测SOX18在DPCs中的作用，并通过RNA-seq初步研究其调控机制。我们首先发现，与阴性对照组相比，SOX18的过表达促进了DPCs的增殖，而SOX18的干扰则产生相反的效果。为了进一步了解SOX18的调控机制，我们在敲低湖羊DPCs中的SOX18后进行了RNA-seq分析。结果表明，Wnt/β-Catenin信号通路参与了SOX18敲低后DPC的生长过程。随后，我们使用TOP/FOP-flash、qRT-PCR和Western blot（WB）分析研究了SOX18对DPCs中Wnt/β-Catenin信号通路的影响。我们的数据表明，SOX18可以激活DPCs中的Wnt/β-Catenin信号通路。此外，我们观察到SOX18可以在抑制Wnt/β-Catenin信号通路后挽救DPCs的增殖。这些发现强调了SOX18作为控制DPCs增殖的功能分子的重要作用。此外，这些发现也极大地增进了我们对SOX18在DPCs增殖和湖羊毛发生长中作用的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SOX18在湖羊真皮乳头细胞增殖中的作用及其调控机制是什么？
- 核心机制
- SOX18通过激活Wnt/β-Catenin信号通路促进DPCs增殖。
- 主要证据
- 过表达SOX18促进DPC增殖，敲低抑制；RNA-seq显示Wnt通路相关基因表达变化；TOP/FOP-flash、qRT-PCR和WB验证了SOX18增强Wnt/β-Catenin活性；ICG001抑制通路后，SOX18过表达可挽救细胞增殖。
- 研究意义
- 揭示SOX18在湖羊DPC增殖中的作用，加深对湖羊毛发生长机制的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SOX18过表达与敲低实验
评估SOX18对DPC增殖的影响
构建SOX18过表达载体（pcDNA3.1-SOX18）转染DPCs；设计三种siRNA敲低SOX18，筛选最有效序列；通过qRT-PCR、WB、CCK-8、EdU和流式细胞术检测增殖相关指标。
RNA-seq分析
鉴定SOX18敲低后的差异表达基因及富集通路
对siR-SOX18和siR-NC组DPCs进行RNA-seq，鉴定DEGs（|FC|≥2, FDR<0.05），进行GO和KEGG富集分析。
Wnt/β-Catenin通路验证
验证SOX18对Wnt/β-Catenin通路的调控作用
通过TOP/FOP-flash检测β-catenin/TCF转录活性；qRT-PCR检测通路相关基因（CTNNB1, TCF4, LEF1, c-MYC, cyclinD1）mRNA水平；WB检测β-Catenin蛋白表达。
挽救实验
证实SOX18通过Wnt/β-Catenin通路调控DPC增殖
用ICG001（30 µM）抑制Wnt/β-Catenin通路，检测DPC增殖；然后过表达SOX18，观察能否挽救增殖抑制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM-F12培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素-两性霉素 | Solarbio | -- | |
| 细胞培养箱 | Thermo | -- | |
| 细胞转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Takara | -- |
| cDNA合成 | 一步法反转录试剂盒 | Tiagen | -- |
| qRT-PCR | 2×TSINGKE® qPCR预混液 | Tsingke | -- |
| 载体构建 | PrimeSTAR® Max DNA聚合酶 | Takara | -- |
| 免疫荧光 | ACTA1兔多克隆抗体 | Sangon Biotech | D121592 |
| PDGFRA兔单克隆抗体 | Abcam | ab203491 | |
| VCAN兔多克隆抗体 | Santa Cruz Biotech | D223532 | |
| 波形蛋白小鼠单克隆抗体 | Santa Cruz Biotech | sc-6260 | |
| SOX18抗体 | Bioss | bs-17135R | |
| 山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor® 555） | Abcam | Ab150078 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor®555） | Abcam | Ab150114 | |
| CCK-8实验 | CCK-8试剂盒 | Vazyme | -- |
| 酶标仪 | EnSpire, Perkin Elmer | -- | |
| EdU实验 | EdU Apollo体外成像试剂盒 | RiboBio | -- |
| 倒置荧光显微镜 | Nikon | -- | |
| 细胞周期实验 | 碘化丙啶 | Solarbio | -- |
| 核糖核酸酶A | TianGen | -- | |
| FACSAria SORP流式细胞仪 | BD company | -- | |
| TOP/FOP-flash实验 | TOP/FOP-flash质粒 | Beyotime | -- |
| 双荧光素酶检测试剂盒 | Vazyme | -- | |
| Western blot | RIPA细胞裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Vazyme | -- | |
| PVDF膜 | Solarbio | -- | |
| 蛋白质印迹转膜仪 | BIO-RAD | -- | |
| 剥离缓冲液 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 电化学发光液 | Beyotime | -- | |
| ChemDocTMTouch成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| PCNA兔多克隆抗体 | Affinity Biosciences | AF0239 | |
| β-连环蛋白小鼠单克隆抗体 | Beyotime | AF0069 | |
| GAPDH小鼠单克隆抗体 | proteintech | 60004-1-Ig | |
| 山羊抗兔IgG H&L（HRP） | Abcam | ab6721 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（HRP） | Abcam | ab205719 | |
| RNA-seq | Trizol试剂盒 | Invitrogen | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| NEB Next Ultra RNA文库制备试剂盒（Illumina） | New England Biolabs | 7530 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| Illumina Novaseq6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分离与培养 | 湖羊皮肤来源（3日龄），培养条件（DMEM-F12+10%FBS+1%双抗，37°C，5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods, 5.2 |
| SOX18过表达/敲低 | 过表达载体（pcDNA3.1-SOX18），siRNA序列及浓度（siRNA-2537, 30 nM），转染试剂（jetPRIME） 阅读提示：Materials and Methods, 5.4 |
| 细胞增殖检测 | CCK-8检测时间点（0,24,48,72h），EdU检测时间（转染后48h），细胞周期检测时间（转染后48h） 阅读提示：Materials and Methods, 5.6, 5.7, 5.8 |
| Wnt/β-Catenin通路检测 | TOP/FOP-flash质粒及pRL-TK共转染，双荧光素酶检测试剂盒，qRT-PCR和WB检测条件 阅读提示：Materials and Methods, 5.9, 5.10 |
| RNA-seq | 每组3个重复，转染后48h收集细胞，参考基因组版本，差异筛选标准（|FC|≥2, FDR<0.05） 阅读提示：Materials and Methods, 5.11 |
| 统计学分析 | n=3，使用未配对Student's t-test，显著性水平p<0.05 阅读提示：Materials and Methods, 5.12 |