临床样本分析
比较URSA患者与正常对照蜕膜组织中焦亡相关蛋白和巨噬细胞亚群的差异。
收集URSA和正常早孕蜕膜组织，通过Western blot检测GSDMD、GSDMD-N、pro-caspase-1、mature caspase-1表达，流式细胞术分析巨噬细胞总数、存活/死亡比例及M1/M2比例。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
探讨MITA-TRIM38相互作用在调节细胞焦亡和维持母胎界面免疫耐受中的作用
Investigation into the role of the MITA-TRIM38 interaction in regulating pyroptosis and maintaining immune tolerance at the maternal-fetal interface.
实验完整度
高包含临床样本（URSA与正常对照蜕膜组织）、体外细胞模型（THP-1极化巨噬细胞及293T细胞）、分子机制验证（Co-IP、泛素化分析、基因敲低）等多个独立证据层级。
主要模型
URSA患者蜕膜组织和正常早孕蜕膜组织 THP-1细胞极化的M1和M2巨噬细胞 293T细胞（外源过表达）
重点核对
URSA组与对照组蜕膜组织中MITA和焦亡相关蛋白表达差异 M1和M2巨噬细胞中MITA和TRIM38的K48泛素化水平 TRIM38和MITA敲低后M1/M2巨噬细胞的焦亡和极化变化 VX765抑制caspase-1对M1巨噬细胞焦亡和MITA表达的影响
摘要
母胎界面在免疫微环境方面与肿瘤组织有相似之处。正常妊娠依赖于免疫抑制状态得以维持，但由MITA诱导的细胞焦亡可触发机体免疫反应，破坏母胎界面的免疫抑制状态，导致流产。在本研究中，我们探讨了MITA和TRIM38在妊娠期间调节细胞焦亡和维持母胎界面免疫耐受中的作用。我们的研究结果表明，MITA与TRIM38之间的相互作用在维持母胎界面的免疫抑制状态中起着至关重要的作用。具体而言，我们观察到在M2巨噬细胞中，TRIM38介导的MITA的K48泛素化水平较高，导致MITA表达水平较低，从而抑制了细胞焦亡。相反，在M1巨噬细胞中，K48泛素化水平较低，导致MITA表达水平较高，促进了细胞焦亡。我们的结果还表明，细胞焦亡在阻碍M1向M2转化以及维持母胎界面免疫抑制状态方面发挥了重要作用。这些发现有助于阐明支持母胎界面免疫耐受微环境维持的机制，对确保成功妊娠至关重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MITA与TRIM38的相互作用及其介导的K48泛素化如何调节巨噬细胞焦亡，从而维持母胎界面的免疫耐受？
- 核心机制
- 在M2巨噬细胞中，TRIM38介导MITA的K48泛素化降解，降低MITA表达，抑制焦亡；在M1巨噬细胞中，MITA高表达促进焦亡，且焦亡抑制M1向M2转化。
- 主要证据
- 临床样本中URSA组MITA和焦亡蛋白表达升高，K48泛素化降低；M2中K48泛素化高、MITA低表达；敲低MITA减少焦亡，敲低TRIM38增加焦亡；VX765抑制焦亡并促进M1向M2转化。
- 研究意义
- 揭示MITA-TRIM38相互作用通过K48泛素化调控焦亡，维持母胎界面免疫耐受，为URSA的发病机制提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MITA和TRIM38表达及泛素化分析
检测URSA与对照蜕膜组织中MITA、TRIM38的表达和K48泛素化水平，并验证两者相互作用。
通过IHC、IF、Western blot、qPCR检测MITA和TRIM38表达；通过免疫沉淀检测泛素化水平，Co-IP检测TRIM38与MITA的内源相互作用。
体外极化巨噬细胞模型
建立M1和M2巨噬细胞模型，验证焦亡相关蛋白表达和MITA的泛素化差异。
THP-1细胞经PMA诱导为M0，再用IFN-γ和LPS极化M1，IL-4和IL-13极化M2；检测上清液中焦亡蛋白表达，细胞内MITA和TRIM38表达及泛素化水平，Co-IP验证相互作用。
TRIM38结构域功能分析
验证TRIM38的RING、B-box和SPRY结构域对与MITA相互作用及K48泛素化的影响。
在293T细胞中共转染Flag-TRIM38（野生型及缺失突变体）与HA-MITA、His-K48，通过Co-IP检测相互作用和泛素化。
焦亡抑制对M1巨噬细胞的影响
探讨抑制焦亡对MITA表达、K48泛素化及M1向M2转化的影响。
在M1极化过程中加入caspase-1抑制剂VX765，检测焦亡细胞形态、GSDMD-N、caspase-1表达，MITA和cGAS表达，MITA的K48泛素化，以及M1/M2标志物变化。
敲低TRIM38和MITA对焦亡及极化的影响
验证TRIM38和MITA在巨噬细胞焦亡和极化中的功能。
用慢病毒敲低THP-1细胞中的TRIM38和/或MITA，极化M1/M2后检测K48泛素化水平、MITA表达、GSDMD-N水平及极化效率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和极化 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 | Gibco | -- | |
| 佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯 | Sigma | P1585 | |
| 细胞极化 | 干扰素-γ | R&D Systems | 285-IF |
| 脂多糖 | Sigma | L2630 | |
| 白细胞介素4 | R&D Systems | 204-IL | |
| 白细胞介素13 | R&D Systems | 213-ILB | |
| 药物处理 | 贝纳卡桑 | MCE | HY13205 |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | PEI MAX转染试剂 | SenGene | -- |
| 流式细胞术 | CD14抗体 | BD Biosciences | 12-0149-42 |
| CD86抗体 | Biolegend | 305412 | |
| CD209抗体 | Biolegend | 330104 | |
| 活死细胞染料FVS780 | BD Biosciences | 565388 | |
| 牛血清白蛋白 | Merck | V900933 | |
| FACSAria III流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| qPCR | TRIzol试剂 | TaKaRa | -- |
| cDNA逆转录试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | TaKaRa | -- | |
| QuantStudio5实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | GBCBIO Technologies | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Solarbio | -- | |
| 增强化学发光试剂 | Millipore | -- | |
| 抗MITA抗体 | Abcam | 239074 | |
| 抗TRIM38抗体 | Invitrogen | MA5-26235 | |
| 抗caspase-1抗体 | Abcam | 207802 | |
| 抗cleaved GSDMD-N端抗体 | Abcam | 215203 | |
| 抗GSDMD抗体 | Abcam | 210070 | |
| 抗cGAS抗体 | Abcam | 302617 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | 181602 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Abcam | 6721 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | 6789 | |
| 免疫共沉淀 | 抗Flag抗体 | CST | 2368 |
| 抗HA抗体 | Abcam | 236632 | |
| 抗His抗体 | CST | #12698 | |
| 磁珠 | MCE | -- | |
| 正常兔IgG | CST | 2729 | |
| 免疫组织化学 | 抗MITA抗体 | Abcam | 239074 |
| 抗TRIM38抗体 | Invitrogen | MA5-26235 | |
| 山羊抗兔二抗 | SeraCare | 5220-0336 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | SeraCare | 5220-0341 | |
| 苏木素 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 抗CD206抗体 | Proteintech | 60143-1-Ig |
| Alexa Fluor 488酪酰胺 | -- | -- | |
| 抗CD80抗体 | Bioss | bs-1035R | |
| Cy3酪酰胺 | -- | -- | |
| 抗TRIM38抗体 | Invitrogen | 334BAA80 | |
| Cy5酪酰胺 | -- | -- | |
| 抗MITA抗体 | Abcam | ab239073 | |
| 显微镜 | Olympus BX50荧光显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | URSA组和对照组各4例，患者年龄、停经天数、HCG阳性，URSA组有反复流产史，对照组正常早孕人工流产。 阅读提示：Materials and methods: Collection of clinical samples |
| 细胞极化 | THP-1细胞浓度106/ml，PMA 100 ng/ml诱导M0 24小时；M1极化：IFN-γ 20 ng/ml、LPS 10 pg/ml，48小时；M2极化：IL-4 20 ng/ml、IL-13 20 ng/ml，48小时。 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and polarization and VX765 treatment |
| VX765处理 | VX765工作浓度25 μM，DMSO作为溶剂对照，与IFN-γ和LPS同时加入。 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and polarization and VX765 treatment |
| 敲低实验 | 慢病毒敲低TRIM38（Santa Cruz #sc-95352-V）和MITA（GenePharma #D01001），MOI 1:100。 阅读提示：Materials and methods: Knockdown of TRIM38 and MITA in THP-1 cells |
| 蛋白检测 | Western blot抗体：MITA (#239074 Abcam)、TRIM38 (#MA5-26235 Invitrogen)、GSDMD (#210070 Abcam)、GSDMD-N (#215203 Abcam)、caspase-1 (#207802 Abcam)、cGAS (#302617 Abcam)。 阅读提示：Materials and methods: Western blotting |