通过生物信息学分析和实验验证识别颞叶癫痫的关键钾通道基因

Identification of key potassium channel genes of temporal lobe epilepsy by bioinformatics analyses and experimental verification.

作者信息Lin-Ming Zhang, Ling Chen, Yi-Fei Zhao, Wei-Mei Duan, Lian-Mei Zhong, Ming-Wei Liu
PMID37483435
发布时间2023-07-07
DOI10.3389/fneur.2023.1175007

实验完整度

中

包含动物模型实验和qRT-PCR、免疫组织化学验证,但未进行体外细胞实验或功能获得/丧失验证,机制探讨主要基于生信预测。

主要模型

C57小鼠颞叶癫痫模型

重点核对

小鼠模型建立:氯化锂-匹罗卡品腹腔注射,剂量127 mg/kg锂、50 mg/kg匹罗卡品 TLE模型脑组织样本:每组6只小鼠 qRT-PCR检测:使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR Mix 2.0,GAPDH内参,2^-ΔΔCq法 免疫组化:抗体稀释度1:1000,BIOSS品牌,DAB显色 统计数据比较:Student's t-test,p<0.05

摘要

颞叶癫痫是癫痫最常见的类型之一,其病因和耐药性尚不清楚。人类颞叶癫痫中钾通道的详细机制尚未阐明。因此,本研究旨在利用生物信息学方法挖掘与颞叶癫痫相关的钾通道基因。结果发现,四个关键颞叶癫痫相关钾通道基因被鉴定:钾电压门控通道亚家族E成员1、KCNA2、钾内向整流通道亚家族J成员11和KCNS1。构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络来分析关键颞叶癫痫相关钾通道基因与其他关键模块基因之间的关系。单基因基因集富集分析结果表明,四个关键颞叶癫痫相关钾通道基因与阳离子通道、钾通道、呼吸链和氧化磷酸化高度相关。利用四个mRNA和113个预测转录因子建立了mRNA-TF网络。基于关键颞叶癫痫相关钾通道基因构建了包含七个miRNA、两个mRNA和244个lncRNA的ceRNA网络。三种常见小分子药物(恩氟烷、异丙嗪和咪康唑)靶向KCNA1、KCNA2和KCNS1。检索到十种小分子药物(格列美脲、二氮嗪、左西孟旦和硫喷妥钠等)靶向KCNJ11。与正常小鼠相比,癫痫小鼠模型脑组织中KCNA1、KCNA2、KCNJ11和KCNS1的表达在转录和翻译水平均下调,这与公共数据库人类数据的趋势一致。结果表明,基于生物信息学分析识别了与颞叶癫痫相关的关键钾通道基因,以探讨钾通道基因在颞叶癫痫发展和治疗中的潜在意义。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
哪些钾通道基因与颞叶癫痫发病相关,其表达变化如何?
核心机制
KCNA1、KCNA2、KCNJ11和KCNS1的下调可能损害兴奋性神经元复极化,降低动作电位发放阈值,导致网络过度兴奋和癫痫易感性增加。
主要证据
基于GEO数据集GSE134697的WGCNA和差异表达分析鉴定四个基因,并在C57小鼠颞叶癫痫模型中通过qRT-PCR和免疫组化验证其mRNA和蛋白水平下调。
研究意义
为颞叶癫痫的发病机制提供理论基础,靶向这些基因的治疗策略是未来研究方向。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

生物信息学分析鉴定关键钾通道基因

利用GEO数据集筛选与TLE相关的关键钾通道基因

对GSE134697数据集进行WGCNA分析,鉴定与TLE显著相关的模块(MEindianred4),并筛选差异表达基因与钾通道基因取交集获得TERKPCGs。

2

调控网络构建

预测TERKPCGs的上游转录因子和ceRNA调控机制

使用KnockTF预测TF,miRWalk预测miRNAs,StarBase预测lncRNAs,构建TF-mRNA网络和ceRNA网络。

3

小分子药物预测

寻找靶向TERKPCGs的潜在治疗药物

使用DrugBank数据库预测靶向TERKPCGs的小分子药物。

4

动物模型建立及表达验证

验证TERKPCGs在TLE模型中的表达变化

建立锂-匹罗卡品诱导的C57小鼠癫痫模型,收集脑组织,通过qRT-PCR和免疫组化检测四个基因的表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
锂----
匹罗卡品----
Nuclezol LS RNA提取试剂ABP Biosciences Inc.--
SureScript第一链cDNA合成试剂盒GeneCopoeia--
BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR Mix 2.0GeneCopoeia--
KCNA1抗体BIOSSbs-8691R
KCNA2抗体BIOSSbs-12182R
KCNJ11抗体BIOSSbs-2436R
KCNS1抗体BIOSSbs-16916R
兔抗鼠IgG H&L (HRP)ZSGB-Biobs-0296R
显微镜(Zeiss, Lab. A1)Zeiss--
Image-Pro PlusMedia Cybernetics--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立
小鼠品系(C57)、性别、年龄、体重;氯化锂剂量(127 mg/kg)、注射途径(i.p.)、注射时间;阿托品注射时机;匹罗卡品剂量(50 mg/kg)、注射途径(i.p.);地西泮剂量(5 mg/kg)及注射时机(SE后90分钟);对照组处理(0.9% NaCl);饲养条件(温度、湿度、光暗周期)
阅读提示:Methods: Animals and in vivo study
RNA提取和qRT-PCR
RNA提取试剂(Nuclezol LS)、逆转录试剂盒(SureScript)、qPCR Mix(BlazeTaq SYBR Green);引物序列(见表1);PCR程序(95°C 30s, 40 cycles 95°C 10s, 60°C 20s, 72°C 30s);内参基因(GAPDH);数据分析方法(2^-ΔΔCq)
阅读提示:Methods: Extraction of RNA and quantitative real-time polymerase chain reaction; Table 1
免疫组化
组织固定、包埋、切片厚度(4μm);抗原修复条件(柠檬酸缓冲液pH6.0, 加热15分钟);一抗稀释度(1:1000)、孵育时间(1小时室温);二抗孵育时间(30分钟37°C);DAB显色;复染;图像采集和阳性率统计方法(5个高倍视野×200)
阅读提示:Methods: Immunohistochemistry
统计方法
两组比较使用Student's t-test;p<0.05显著性水平;数据表示方式(均值±标准差?)
阅读提示:Methods: Statistics analysis; Results: Figure 5