验证oar-miR-432直接靶向DDI1
通过双荧光素酶报告实验验证oar-miR-432是否直接与DDI1 3'UTR结合。
将包含预测结合位点的野生型或突变型DDI1 3'UTR克隆至psiCHECK2载体，与oar-miR-432 mimic或NC共转染HEK293T细胞，检测荧光素酶活性。
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DDI1通过oar-miR-432诱导绵羊前脂肪细胞分化的作用研究
The Effects of DDI1 on Inducing Differentiation in Ovine Preadipocytes via Oar-miR-432.
实验完整度
高包含体外细胞模型（绵羊前脂肪细胞、HEK293T）、双荧光素酶报告实验、过表达/敲低功能验证、油红O染色、Western blot及RT-qPCR等多层级验证。
主要模型
绵羊原代前脂肪细胞 HEK293T细胞
重点核对
双荧光素酶报告实验验证oar-miR-432与DDI1 3'UTR直接结合 使用oar-miR-432 mimic和inhibitor转染前脂肪细胞检测DDI1表达 DDI1过表达和敲低慢病毒转染前脂肪细胞（MOI=100） 油红O染色评估脂滴形成 RT-qPCR和Western blot检测DDI1、PPAR-γ、FABP4、ACACA和PDGFD表达
摘要
减少绵羊尾部脂肪沉积是应对成本上升和控制消费者偏好的最重要途径之一。我们先前的研究表明，oar-miR-432在湖羊（脂尾品种）和藏羊（瘦尾品种）的尾部脂肪组织中差异表达，并且是通过绵羊前脂肪细胞中的BMP2负调控脂肪沉积的关键因子。本研究探讨了oar-miR-432及其靶基因在绵羊前脂肪细胞中的作用。双荧光素酶实验揭示DDI1是oar-miR-432的直接靶基因。我们将oar-miR-432模拟物和抑制剂转染至前脂肪细胞中，分析靶基因的表达。oar-miR-432的过表达抑制DDI1的表达，而抑制则显示相反的结果。与瘦尾羊相比，脂尾羊中DDI1在mRNA和蛋白水平均高表达。此外，我们将靶基因的过表达和敲低载体转染至前脂肪细胞中，分析其在诱导分化后的影响。DDI1的敲低诱导绵羊前脂肪细胞分化为脂肪细胞，但抑制了oar-miR-432的表达。相反，DDI1的过表达显著抑制分化，但促进oar-miR-432的表达。DDI1过表达也降低了甘油三酯的含量。此外，DDI1是PDGFD内含子1中的一个嵌套基因。当DDI1过表达时，PDGFD的表达也增加，而DDI1敲低则显示相反的结果。这是首次揭示oar-miR-432通过DDI1抑制绵羊前脂肪细胞分化的生物学机制，并提供了DDI1在绵羊前脂肪细胞中分子调控机制的见解。这些结果在动物育种和肥胖相关人类疾病中具有重要应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- oar-miR-432及其靶基因DDI1在绵羊前脂肪细胞分化中如何调控脂肪沉积？
- 核心机制
- oar-miR-432直接靶向并负调控DDI1表达；DDI1抑制前脂肪细胞分化并降低脂肪合成标志基因表达，同时DDI1负反馈调控oar-miR-432表达，且DDI1与PDGFD共表达。
- 主要证据
- 双荧光素酶实验证明oar-miR-432靶向DDI1 3'UTR；过表达oar-miR-432抑制DDI1 mRNA和蛋白表达；DDI1敲低促进前脂肪细胞分化，油红O染色显示脂滴增加，PPAR-γ、FABP4和ACACA表达升高；DDI1过表达抑制分化，降低甘油三酯含量；DDI1与PDGFD共表达。
- 研究意义
- 首次揭示oar-miR-432通过DDI1调控绵羊前脂肪细胞分化的机制，为动物育种和肥胖相关人类疾病提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测oar-miR-432对DDI1表达的影响
观察oar-miR-432过表达或抑制对DDI1 mRNA和蛋白表达的影响。
将oar-miR-432 mimic、inhibitor或NC转染至绵羊前脂肪细胞，诱导分化后于第2天和第4天收集细胞，提取RNA和蛋白，分别进行RT-qPCR和Western blot检测DDI1表达。
检测DDI1对oar-miR-432表达的影响
探究DDI1过表达或敲低是否影响oar-miR-432的表达。
利用慢病毒介导的DDI1过表达或敲低转染前脂肪细胞，成功转染后收集细胞提取RNA，通过RT-qPCR检测oar-miR-432的表达，并设置NC对照。
验证DDI1对前脂肪细胞分化的影响
评估DDI1过表达或敲低对前脂肪细胞成脂分化的影响。
通过慢病毒介导的DDI1过表达或敲低处理前脂肪细胞，诱导分化后通过RT-qPCR和Western blot检测PPAR-γ、FABP4和ACACA的表达，并使用油红O染色观察脂滴形成。
检测DDI1与PDGFD的共表达关系
探讨DDI1过表达或敲低是否影响PDGFD的表达。
在DDI1过表达或敲低的前脂肪细胞中，通过RT-qPCR和Western blot检测PDGFD的mRNA和蛋白表达水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | opti培养基 | Gibco | -- |
| 诱导分化 | 地塞米松 | Macklin | -- |
| 异丁基甲基黄嘌呤 | Macklin | -- | |
| 维持分化 | 胰岛素 | Macklin | -- |
| 油红O染色 | 油红O染液 | Solarbio | -- |
| 异丙醇 | -- | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNAprep纯化试剂盒 | TIANGEN | -- | |
| Prime Script II 第一链cDNA合成试剂盒 | Takara | -- | |
| miRNA RT-qPCR | miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | MR101-01/02 |
| miRNA通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | MQ101-01/02 | |
| mRNA RT-qPCR | TB Green Premix Ex Taq | Takara | RR420L |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂 | Thermo Scientific | 23235 | |
| 4x还原型上样缓冲液 | Thermo Scientific | NP0007 | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| Bio-Rad转印系统 | Bio-Rad | 1703930 | |
| 脱脂奶粉 | Thermo Scientific | LP0031B | |
| 抗DDI1抗体 | Proteintech | 13968-1-AP | |
| 抗PDGFD抗体 | Bioss | bs-5776R | |
| 抗PPAR-γ抗体 | Proteintech | 60127-1-Ig | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 66240-1-Ig | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Bioss | bs-0061R | |
| TBST缓冲液 | Solarbio | T1085 | |
| 二抗 | Abcam | ab6721 | |
| 增强化学发光试剂 | Thermo Scientific | 32209 | |
| Tanon 5200成像系统 | Tanon | -- | |
| 仪器设备 | Nanodrop 2000核酸蛋白分析仪 | Thermo | -- |
| 显微观察 | 徕卡显微镜 | Leica | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分离与培养 | 绵羊原代前脂肪细胞分离自70日龄胎羊尾部脂肪组织；细胞培养于DMEM（含10% FBS和5% PS） 阅读提示：Materials and Methods 4.1 |
| 双荧光素酶报告实验 | HEK293T细胞，每孔1×10^4细胞；转染100 ng重组载体和20 nM oar-miR-432 mimic或NC；转染后48小时检测 阅读提示：Materials and Methods 4.2，图2 |
| 细胞转染 | oar-miR-432 mimic/inhibitor/NC浓度20 nM；慢病毒MOI=100；诱导分化培养基含1 µM地塞米松和0.5 mM IBMX，维持培养基含10 mg/mL胰岛素 阅读提示：Materials and Methods 4.3，图4 |
| 油红O染色 | 细胞固定用4%多聚甲醛，染色用油红O溶液，洗涤用60%异丙醇，显微镜放大倍数40× 阅读提示：Materials and Methods 4.4，图5 |
| RT-qPCR | 绵羊尾部脂肪组织样本：3只湖羊和3只藏羊（6月龄成年母羊）；内参基因β-actin；引物序列见表1；qPCR条件：95°C 5 min，40个循环（95°C 10 s, 60°C 30 s），熔解曲线分析 阅读提示：Materials and Methods 4.5，表1 |
| Western blot | 蛋白提取使用RIPA裂解液，BCA定量；上样量20 µg；SDS-PAGE后转PVDF膜；抗体信息：anti-DDI1 (44 kDa, Proteintech #13968-1-AP)、anti-PDGFD (57 kDa, Bioss #bs-5776R)、anti-PPAR-γ (58 kDa, Proteintech #60127-1-Ig)、anti-β-tubulin (50 kDa, Proteintech #66240-1-Ig)、anti-β-actin (42 kDa, Bioss #bs-0061R) 阅读提示：Materials and Methods 4.6 |
| 统计分析 | 两组比较用非配对t检验，多组比较用单因素方差分析，p<0.05表示统计学显著;数据以mean±SEM表示 阅读提示：Materials and Methods 4.7 |