耐力运动诱导的Fgf21通过TGF-β1和p38 MAPK信号通路促进骨骼肌纤维类型转化

Endurance Exercise-Induced Fgf21 Promotes Skeletal Muscle Fiber Conversion through TGF-β1 and p38 MAPK Signaling Pathway.

作者信息Xiaomao Luo, Huiling Zhang, Xiaorui Cao, Ding Yang, Yi Yan, Jiayin Lu, Xiaonan Wang, Haidong Wang
PMID37511159
发布时间2023-07-13
DOI10.3390/ijms241411401

实验完整度

包含体内实验(Fgf21 KO小鼠模型、耐力运动训练、rhFgf21干预)和体外实验(C2C12细胞过表达Fgf21、通路抑制剂),并进行功能验证(肌力、跑步时间)和机制验证(Western blot、qPCR、免疫荧光)。

主要模型

野生型C57BL/6小鼠(耐力运动训练模型) Fgf21基因敲除小鼠(C57BL/6N-Fgf21em1cyage) C2C12成肌细胞系

重点核对

耐力运动训练方案:跑台训练8周,每周5天,每天1小时,速度从8 m/min逐渐增至12 m/min Fgf21 KO小鼠由CRISPR/Cas9技术构建,需验证基因敲除效率 rhFgf21给药剂量:1.5 mg/kg,连续7天 C2C12细胞分化诱导:2%马血清处理5天

摘要

Fgf21已被发现在肌肉生长和功能中发挥调节作用。尽管耐力训练调节骨骼肌的机制已被广泛研究,但Fgf21的贡献仍知之甚少。在此,我们测量了肌肉大小和功能,并通过免疫组织化学、免疫印迹或qPCR评估了耐力运动训练的野生型和Fgf21 KO小鼠的纤维类型标志物。我们还研究了Fgf21在C2C12细胞中诱导的纤维类型转化,这些细胞用慢病毒和/或通路抑制剂孵育。我们发现耐力运动训练提高了肝脏和腓肠肌(GAS)中Fgf21的水平以及运动能力,并减少了骨骼肌纤维大小的分布,观察到小鼠GAS肌肉中快肌纤维向慢肌纤维转化。Fgf21通过抑制TGF-β1信号轴和激活p38 MAPK信号通路,促进纤维类型转变标志物和eMyHC阳性肌管的形成,且无明显交叉对话。我们的研究结果表明,骨骼肌纤维类型对耐力训练的反应转化可能由Fgf21及其下游信号通路介导。我们的结果阐明了Fgf21在耐力运动诱导的纤维类型转化中的作用机制,并提示Fgf21在改善肌肉健康和对抗疲劳方面的潜在用途。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
耐力运动训练是否通过Fgf21及其下游信号通路(TGF-β1和p38 MAPK)诱导骨骼肌纤维类型从快肌向慢肌转化?
核心机制
Fgf21通过抑制TGF-β1-Smad2/3-MMP9信号轴并激活p38 MAPK信号通路,促进快肌纤维向慢肌纤维转化。
主要证据
耐力运动训练增加Fgf21表达并改变纤维类型;Fgf21过表达在C2C12细胞中调控MyHC表达;Fgf21 KO小鼠阻断纤维类型转化,而rhFgf21逆转该效应;通路抑制剂实验证实TGF-β1和p38 MAPK通路参与。
研究意义
揭示Fgf21在耐力运动诱导的纤维类型转化中的作用机制,为改善肌肉健康和对抗疲劳提供潜在应用方向。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

动物模型建立与耐力运动训练

建立耐力运动训练小鼠模型,观察运动对Fgf21表达和肌肉功能的影响

对野生型C57BL/6小鼠进行8周跑台耐力训练,检测Fgf21表达、运动能力(握力、跑步时间)和肌纤维横截面积分布

2

体内纤维类型分析

评估耐力运动对GAS肌纤维类型转变的影响

通过免疫印迹、qPCR和免疫荧光检测MyHC I, IIa, IIb, IIx的表达及分布

3

体外C2C12细胞过表达Fgf21实验

验证Fgf21直接调控肌管形成和纤维类型标志物

用LV-Fgf21感染C2C12细胞,诱导分化,检测MyHC表达、肌管形成和信号通路蛋白

4

信号通路抑制剂验证

确定Fgf21调控纤维类型是否依赖TGF-β1和p38 MAPK通路

使用SB431542(TGF-β1抑制剂)和SB203580(p38抑制剂)处理C2C12细胞,检测MyHC和通路蛋白变化

5

Fgf21基因敲除和rhFgf21干预实验

验证Fgf21在体内的必要性及其逆转作用

使用Fgf21 KO小鼠进行耐力训练,并给予rhFgf21治疗,检测运动能力、纤维类型和信号通路

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
重组人FGF21蛋白ThermoFisher100-42
电动跑台SA101SA101
握力测试仪----
Fgf21 ELISA试剂盒R&DMF2100
兔抗Laminin抗体InvitrogenPA1-16730
兔抗MyHC I抗体Proteintech22280-1-AP
兔抗MyHC IIa抗体Abcamab124937
兔抗MyHC IIb抗体Proteintech20140-1-AP
小鼠抗MyHC IIx抗体Proteintech67299-1-Ig
山羊抗兔Alexa Fluor 488二抗Abcamab150077
山羊抗小鼠Alexa Fluor 488二抗Abcamab150113
DAPI染液SolarbioS2110
荧光显微镜Nikon Eclipse Ts-2R--
小鼠抗eMyHC抗体Santa CruzSC-53091
Alexa Fluor 594二抗Abcamab150116
RIPA裂解液SolarbioR0010
蛋白酶抑制剂混合物Merck539133
BCA蛋白定量试剂盒BeyotimeP0012
PVDF膜MerckISEQ00010
兔抗Fgf21抗体Abcamab171941
兔抗TGF-β1抗体Biossbs-0086R
兔抗Smad2/3抗体InvitrogenPA5-99539
兔抗磷酸化p38 MAPK抗体CST8690
小鼠抗Tubulin抗体Sigma-AldrichT6199
小鼠抗β-actin抗体CST4967
HRP标记的山羊抗小鼠二抗CWBIOCW0102S
HRP标记的山羊抗兔二抗CWBIOCW0156S
增强化学发光试剂SolarbioPEOO10
TRIzol™试剂Invitrogen15596018
NanoDrop分光光度计ThermoFisher--
M-MLV逆转录酶ThermoFisher18064071
SYBR MixVazymeQ711-02
Biosystems QuantStudio5实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--
C2C12细胞系ATCCCRL-1772
DMEM培养基----
胎牛血清Tianhang11011
SB431542抑制剂SelleckS1067
SB203580抑制剂Sigma-AldrichS8307
PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体----
PCR筛选ThermoFisher4375786
PCR引物Sangon Biotech--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
耐力运动训练
小鼠品系、性别、年龄;训练跑台速度、时间、频率、周期;饮食条件
阅读提示:Materials and Methods, 4.1 Animal Experiments
Fgf21 KO小鼠模型
基因敲除构建方法(CRISPR/Cas9)、靶序列、基因型鉴定方法
阅读提示:Materials and Methods, 4.2 Wild-Type Generation of Fgf21 Knockout Mouse Model
rhFgf21处理
给药剂量、给药途径(注射)、给药时间、对照组设置
阅读提示:Materials and Methods, 4.1 Animal Experiments
C2C12细胞分化
细胞来源、培养条件、分化诱导条件(2%马血清、时间)
阅读提示:Materials and Methods, 4.7 Cell culture and Differentiation
信号通路抑制剂处理
抑制剂种类、浓度、处理时间、溶剂对照
阅读提示:Materials and Methods, 4.7 Cell culture and Differentiation
Western blot分析
蛋白提取方法、抗体信息、内参选择、上样量
阅读提示:Materials and Methods, 4.5 Western Blotting
qPCR分析
RNA提取方法、逆转录条件、引物序列、内参基因
阅读提示:Materials and Methods, 4.6 RNA Extraction, Reverse Transcript, and Quantitative Real-Time PCR; Supplementary Table S2
免疫荧光分析
抗体浓度、孵育条件、切片厚度、图像采集和定量方法
阅读提示:Materials and Methods, 4.4 Immunofluorescence Staining and Analysis