动物模型建立与耐力运动训练
建立耐力运动训练小鼠模型,观察运动对Fgf21表达和肌肉功能的影响
对野生型C57BL/6小鼠进行8周跑台耐力训练,检测Fgf21表达、运动能力(握力、跑步时间)和肌纤维横截面积分布
Endurance Exercise-Induced Fgf21 Promotes Skeletal Muscle Fiber Conversion through TGF-β1 and p38 MAPK Signaling Pathway.
包含体内实验(Fgf21 KO小鼠模型、耐力运动训练、rhFgf21干预)和体外实验(C2C12细胞过表达Fgf21、通路抑制剂),并进行功能验证(肌力、跑步时间)和机制验证(Western blot、qPCR、免疫荧光)。
野生型C57BL/6小鼠(耐力运动训练模型) Fgf21基因敲除小鼠(C57BL/6N-Fgf21em1cyage) C2C12成肌细胞系
耐力运动训练方案:跑台训练8周,每周5天,每天1小时,速度从8 m/min逐渐增至12 m/min Fgf21 KO小鼠由CRISPR/Cas9技术构建,需验证基因敲除效率 rhFgf21给药剂量:1.5 mg/kg,连续7天 C2C12细胞分化诱导:2%马血清处理5天
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立耐力运动训练小鼠模型,观察运动对Fgf21表达和肌肉功能的影响
对野生型C57BL/6小鼠进行8周跑台耐力训练,检测Fgf21表达、运动能力(握力、跑步时间)和肌纤维横截面积分布
评估耐力运动对GAS肌纤维类型转变的影响
通过免疫印迹、qPCR和免疫荧光检测MyHC I, IIa, IIb, IIx的表达及分布
验证Fgf21直接调控肌管形成和纤维类型标志物
用LV-Fgf21感染C2C12细胞,诱导分化,检测MyHC表达、肌管形成和信号通路蛋白
确定Fgf21调控纤维类型是否依赖TGF-β1和p38 MAPK通路
使用SB431542(TGF-β1抑制剂)和SB203580(p38抑制剂)处理C2C12细胞,检测MyHC和通路蛋白变化
验证Fgf21在体内的必要性及其逆转作用
使用Fgf21 KO小鼠进行耐力训练,并给予rhFgf21治疗,检测运动能力、纤维类型和信号通路
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 重组人FGF21蛋白 | ThermoFisher | 100-42 |
| 电动跑台 | SA101 | SA101 | |
| 握力测试仪 | -- | -- | |
| ELISA | Fgf21 ELISA试剂盒 | R&D | MF2100 |
| 免疫荧光 | 兔抗Laminin抗体 | Invitrogen | PA1-16730 |
| 兔抗MyHC I抗体 | Proteintech | 22280-1-AP | |
| 兔抗MyHC IIa抗体 | Abcam | ab124937 | |
| 兔抗MyHC IIb抗体 | Proteintech | 20140-1-AP | |
| 小鼠抗MyHC IIx抗体 | Proteintech | 67299-1-Ig | |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 488二抗 | Abcam | ab150077 | |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 488二抗 | Abcam | ab150113 | |
| DAPI染液 | Solarbio | S2110 | |
| 荧光显微镜 | Nikon Eclipse Ts-2R | -- | |
| 免疫荧光(细胞) | 小鼠抗eMyHC抗体 | Santa Cruz | SC-53091 |
| Alexa Fluor 594二抗 | Abcam | ab150116 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Merck | 539133 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 | |
| PVDF膜 | Merck | ISEQ00010 | |
| 兔抗Fgf21抗体 | Abcam | ab171941 | |
| 兔抗TGF-β1抗体 | Bioss | bs-0086R | |
| 兔抗Smad2/3抗体 | Invitrogen | PA5-99539 | |
| 兔抗磷酸化p38 MAPK抗体 | CST | 8690 | |
| 小鼠抗Tubulin抗体 | Sigma-Aldrich | T6199 | |
| 小鼠抗β-actin抗体 | CST | 4967 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠二抗 | CWBIO | CW0102S | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | CWBIO | CW0156S | |
| 增强化学发光试剂 | Solarbio | PEOO10 | |
| RNA提取 | TRIzol™试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| NanoDrop分光光度计 | ThermoFisher | -- | |
| RT-qPCR | M-MLV逆转录酶 | ThermoFisher | 18064071 |
| SYBR Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| Biosystems QuantStudio5实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞培养 | C2C12细胞系 | ATCC | CRL-1772 |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Tianhang | 11011 | |
| SB431542抑制剂 | Selleck | S1067 | |
| SB203580抑制剂 | Sigma-Aldrich | S8307 | |
| 慢病毒制备 | PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体 | -- | -- |
| 基因敲除 | PCR筛选 | ThermoFisher | 4375786 |
| PCR引物 | Sangon Biotech | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 耐力运动训练 | 小鼠品系、性别、年龄;训练跑台速度、时间、频率、周期;饮食条件 阅读提示:Materials and Methods, 4.1 Animal Experiments |
| Fgf21 KO小鼠模型 | 基因敲除构建方法(CRISPR/Cas9)、靶序列、基因型鉴定方法 阅读提示:Materials and Methods, 4.2 Wild-Type Generation of Fgf21 Knockout Mouse Model |
| rhFgf21处理 | 给药剂量、给药途径(注射)、给药时间、对照组设置 阅读提示:Materials and Methods, 4.1 Animal Experiments |
| C2C12细胞分化 | 细胞来源、培养条件、分化诱导条件(2%马血清、时间) 阅读提示:Materials and Methods, 4.7 Cell culture and Differentiation |
| 信号通路抑制剂处理 | 抑制剂种类、浓度、处理时间、溶剂对照 阅读提示:Materials and Methods, 4.7 Cell culture and Differentiation |
| Western blot分析 | 蛋白提取方法、抗体信息、内参选择、上样量 阅读提示:Materials and Methods, 4.5 Western Blotting |
| qPCR分析 | RNA提取方法、逆转录条件、引物序列、内参基因 阅读提示:Materials and Methods, 4.6 RNA Extraction, Reverse Transcript, and Quantitative Real-Time PCR; Supplementary Table S2 |
| 免疫荧光分析 | 抗体浓度、孵育条件、切片厚度、图像采集和定量方法 阅读提示:Materials and Methods, 4.4 Immunofluorescence Staining and Analysis |