持续光照引起的急性昼夜节律紊乱促进小鼠海马Caspase 1激活

Acute Circadian Disruption Due to Constant Light Promotes Caspase 1 Activation in the Mouse Hippocampus.

作者信息Pikria Ketelauri, Katerina Scharov, Charlotte von Gall, Sonja Johann
PMID37508501
期刊Cells
发布时间2023-07-12
DOI10.3390/cells12141836

实验完整度

中

研究包含动物模型(小鼠)、行为分析、组织学、基因表达(RT-PCR)和蛋白表达(Western blot)等多个实验层级,但缺乏功能验证,且样本量较小。

主要模型

雄性C57BL/6小鼠(持续光照模型) 小鼠海马组织

重点核对

小鼠品系:C57BL/6雄性,10周龄,每组10只 光照条件:对照组12小时光照/12小时黑暗(LD),实验组持续光照(LL)14天 基因表达分析(RT-PCR):GAPDH和HSP90作为内参,LL组AIM2和Caspase 1 mRNA显著降低 蛋白表达分析(Western blot):LL组裂解的caspase 1蛋白显著升高,但ASC蛋白降低

摘要

在哺乳动物中,昼夜节律系统控制各种生理过程,以在每日24小时周期内维持代谢、行为和免疫功能。虽然由下丘脑中的细胞自主核心时钟驱动,但节律活动被外部线索(如环境光照条件)所引导。夜间人造光(ALAN)暴露可导致昼夜节律紊乱,因此与现代社会中文明疾病发生率的增加有关。此外,昼夜节律的改变和免疫反应(包括炎症小体激活)的失调是神经退行性疾病(包括阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病)的常见特征。尽管有证据表明海马中的炎症小体可被应激激活,但昼夜节律紊乱对炎症小体激活的直接作用仍知之甚少。在本研究中,我们旨在分析持续光照(LL)是否影响小鼠海马中的炎症小体激活。除了昼夜节律强度降低和运动活动减少外,我们发现暴露于LL的小鼠海马中裂解的caspase 1显著升高。然而,我们没有发现炎症小体启动或pro-白细胞介素裂解的标志。这些发现表明,急性昼夜节律紊乱导致组装好的“准备启动”炎症小体,这可能使大脑更容易受到额外有害刺激的影响。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
持续光照引起的急性昼夜节律紊乱是否影响小鼠海马中的炎症小体激活?
核心机制
持续光照导致海马中裂解的caspase 1蛋白水平升高,但未观察到NF-κB磷酸化或pro-IL1β、pro-IL18升高等启动迹象,提示炎症小体组装和激活发生,但启动不足。
主要证据
Western blot显示LL组裂解的caspase 1蛋白显著升高;RT-PCR显示AIM2和Caspase 1 mRNA降低;免疫荧光显示IBA1荧光强度增加。
研究意义
作者认为急性昼夜节律紊乱可能使大脑对额外有害刺激更脆弱,增加炎症、衰老和神经退行性疾病的风险。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

动物分组与持续光照处理

建立急性昼夜节律紊乱的小鼠模型

雄性C57BL/6小鼠适应环境10天后,对照组维持12小时光照/12小时黑暗(LD),实验组暴露于持续光照(LL)14天。

2

行为学分析

验证持续光照是否扰乱昼夜节律

通过红外设备持续监测自发运动活动,计算昼夜节律周期、强度和总活动量。

3

白蛋白细胞计数

评估整体应激反应和炎症状态

心脏采血制备血液涂片,May-Grünwald-Giemsa染色后计数200个白细胞,分类统计。

4

基因表达分析

检测炎症小体组分和细胞因子的转录水平

海马组织提取RNA,逆转录后实时PCR检测AIM2、ASC、Caspase 1、IL18、IL1b、NLRC4、NLRP1b、NLRP3等基因表达。

5

蛋白表达分析

检测炎症小体组分的蛋白水平及裂解情况

海马组织蛋白提取,Western blot检测NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、ASC、pro-caspase 1、cleaved caspase 1、NF-κB p65、P-NF-κB p65、IL1β、IL18等。

6

免疫荧光分析

评估胶质细胞激活情况

海马脑片进行IBA1(小胶质细胞)和GFAP(星形胶质细胞)免疫荧光染色,分析荧光强度。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证分子表达变化
验证免疫效应

产品清单

实验环节名称品牌货号
Mouse-E-Motion----
StepOnePlus实时PCR系统Thermo Fisher--
KAPA SYBR FAST qPCR预混液(2X)试剂盒Kapa Biosystems--
peqGOLD TriFastVWR Life Science--
DNase1Roche--
M-MLV逆转录试剂盒Thermo Fisher Scientific--
RIPA裂解液----
PRECELLYS Evolution组织匀浆器Bertin Technologies--
BCA蛋白定量试剂盒Thermo Fisher Scientific--
Immobilon ECL化学发光底物Millipore--
Chemi Only凝胶成像系统VWR--
柠檬酸盐缓冲液(pH 6)----
Hoechst 33342Invitrogen--
苏丹黑----
基恩士荧光显微镜(BZ-900 E BIOREVO)Keyence--
BZ-II分析软件Keyence--
IBA1抗体Fujifilm Wako019-19741
GFAP抗体DakoZ0334
AIM2抗体Biossbs-5986R
ASC抗体AdipogenAG-25B-0006-C100
Caspase 1抗体AdipogenAG-20B-0042-C100
GAPDH抗体Santa Cruzsc-32233
GFAP抗体Abcamab53554
IBA1抗体Fujifilm Wako019-19741
IL18抗体Santa Cruzsc-7954
IL1β抗体NovusNB600-633
NLRC4抗体Merck06-1125
NLRP1抗体NovusNB100-56148
NLRP3抗体Biossbs-10021R
NF-κB p65抗体Cell Signaling8242S
磷酸化NF-κB p65抗体Cell Signaling3039S
Vinculin抗体Santa Cruzsc-73614
Clocklab软件Actimetrics--
ImageJ软件----
GraphPad Prism 5.0GraphPad--
IBM SPSS Statistics 22IBM--
Entellan封片剂Merck--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
小鼠品系、性别、年龄、饲养条件、光照周期
阅读提示:参见Materials and Methods 2.1节
行为分析
运动活动记录参数、分析软件
阅读提示:参见Materials and Methods 2.2节
基因表达分析
引物序列、内参基因、RNA提取和逆转录试剂
阅读提示:参见Materials and Methods 2.4节及Table 1
蛋白表达分析
抗体信息、蛋白上样量、内参蛋白
阅读提示:参见Materials and Methods 2.5节及Table 2
免疫荧光分析
切片厚度、抗原修复条件、抗体浓度、图像分析区域
阅读提示:参见Materials and Methods 2.6节