PSCs和PADSCs的分离、增殖与分化
获得用于构建培养鱼片的肌肉干细胞和脂肪干细胞，并验证其增殖和分化能力。
从大黄鱼轴上肌和腹腔脂肪组织中分别分离PSCs和PADSCs，优化培养基配方，通过CCK-8、免疫荧光染色和油红O染色评估增殖与分化。
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通过合成食品管道制备组织样养殖鱼片
Tissue-like cultured fish fillets through a synthetic food pipeline.
实验完整度
高包括细胞分离与表征、转录组分析、3D支架材料筛选、3D生物打印构建组织、组织学与质地分析等多个独立实验层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
大黄鱼PSCs体外培养模型 大黄鱼PADSCs体外培养模型 3D生物打印肌肉支架培养模型
重点核对
PSCs分离来源：大黄鱼轴上肌，使用0.1% IV型胶原酶消化1小时和0.1%胰蛋白酶-EDTA消化20分钟 PSCs增殖培养基：高糖DMEM+15% FBS+10 ng/ml bFGF，培养于27°C、5% CO2 成肌分化培养基：F12+8%马血清+10 ng/ml IGF-1+50 nM necrosulfonamide+200 μM抗坏血酸，隔3天半量换液 高效成肌分化：添加5 μM RepSox和10 nM LY411575处理48小时，然后加入等体积含8% FBS和200 nM地塞米松的DMEM培养基 3D打印支架材料：10%鱼明胶/1%海藻酸钠，与5×10^6 cells/mL PSCs混合，打印后经1% CaCl2固化10分钟
摘要
一些家畜的组织样培养肉已经通过不同的方法成功建立。然而，生产类似于鱼片的结构仍然具有挑战性。在这里，我们通过将大黄鱼肌纤维和脂肪细胞与3D打印凝胶组装来开发组织样培养鱼片。抑制Tgf-β和Notch信号显著促进了鱼类卫星细胞（PSCs）的成肌分化。鱼明胶和海藻酸钠的混合物结合p53抑制剂和Yap激活剂支持PSC的活力和增殖。基于鱼肌肉组织的纹理，通过明胶基凝胶混合PSCs构建了3D支架。在增殖和分化后，肌肉支架中填充了培养的鱼类脂肪细胞。最终形成了20×12×4毫米的组织样鱼片，包含5.67×10^7个肌肉细胞和4.02×10^7个脂肪细胞。这里组织样培养鱼片的生物制造可能是一种具有高保真度定制肉类生产的有前景的技术。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用大黄鱼细胞和3D打印技术构建组织样培养鱼片，并解决鱼类细胞体外培养和3D支架构建中的挑战？
- 核心机制
- 抑制TGF-β和Notch信号通路可显著提高PSCs的成肌分化效率，抑制肌成纤维细胞转化；p53抑制剂和Yap激活剂促进PSCs在3D培养中的增殖。
- 主要证据
- PSCs和PADSCs的分离与分化鉴定；转录组分析揭示Notch和TGF-β信号影响成肌效率；3D打印支架上PSCs增殖和分化形成肌管；最终构建的鱼片在细胞数量、肌肉与脂肪比例、质构特性上与天然大黄鱼肌肉相似。
- 研究意义
- 本研究建立了组织样培养鱼片的生产流程，为不同鱼类甚至其他经济动物物种的培育肉生产提供了先进方案，证明了基于真实组织结构的仿生支架在组织样培育肉生产中的巨大潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析改善成肌分化效率
揭示PSCs成肌分化效率低的原因，并确定关键信号通路。
对分化第0、3、6天的PSCs进行bulk RNA-seq，通过差异表达基因、GO和KEGG富集分析，发现Notch和TGF-β信号通路参与调控，并通过抑制这些通路显著提高分化效率。
3D支架材料的筛选与优化
选择适合鱼类细胞3D培养的支架材料，并优化其力学性能。
比较猪明胶、鱼明胶、透明质酸、丝素蛋白和壳聚糖等材料的细胞相容性，通过流变学测试测定胶凝点，并用CaCl2处理调节支架硬度，评估细胞黏附和增殖。
3D生物打印构建仿生肌肉支架
根据大黄鱼肌肉组织的真实结构构建可打印的仿生支架，以引导肌纤维的有序排列。
使用micro-CT扫描并分析大黄鱼肌肉纹理，设计简化的晶格模型，利用3D挤出打印机将混合有PSCs的明胶/海藻酸钠生物墨水打印成支架，并在增殖和分化培养基中培养。
组织样培养鱼片的表征
验证培养鱼片在细胞组成、微观结构和质构特性上是否与天然鱼肉相似。
统计肌肉细胞和脂肪细胞数量，比较肌肉与脂肪比例；通过HE和扫描电镜观察微观结构；进行质构分析和低场核磁共振水分分布分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离与培养 | IV型胶原酶 | Gibco | 17104019 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Cienry | CR25200 | |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Beyotime | P5453 | |
| 青霉素-链霉素 | Macklin | P917928 | |
| 多聚赖氨酸 | Sangon | E607015 | |
| 细胞分离 | I型胶原酶 | Gibco | 17100017 |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | C11330500BT |
| 成肌分化 | 马血清 | Biosharp | BL209A |
| 胰岛素样生长因子-1 | Solarbio | P00048 | |
| 坏死磺酰胺 | Macklin | N872612 | |
| 抗坏血酸 | Phytotech | A106 | |
| 成脂分化 | 胰岛素 | Targetmol | I189675 |
| IBMX | Targetmol | T1713 | |
| 地塞米松 | Targetmol | T0947L | |
| 脂质混合物 | Peprotech | LM-200 | |
| 高效成肌分化 | RepSox | Targetmol | T6337 |
| LY411575 | Targetmol | T6063 | |
| 免疫荧光染色 | Hoechst 33342 | BBI | E607328 |
| Pax7抗体 | Bioss | bs-22741R | |
| MyoD1抗体 | Abcam | ab209976 | |
| Desmin抗体 | Bioss | bs-1026R | |
| HoxC9抗体 | Bioss | bs-7982R | |
| 山羊抗兔IgG二抗，Alexa Fluor 488 | Beyotime | A0423 | |
| 活/死染色 | 钙黄绿素-AM | Solarbio | CA1630 |
| 碘化丙啶 | Solarbio | CA1630 | |
| RNA测序 | Illumina Truseq RNA样品制备试剂盒 | -- | -- |
| 3D细胞培养 | 鱼明胶 | Yuanye | S25295 |
| 猪明胶 | Sigma | V900863 | |
| 丝素蛋白 | Aladdin | W293432 | |
| 透明质酸 | Aladdin | H131007 | |
| 壳聚糖 | Aladdin | C105799 | |
| 海藻酸钠 | Aladdin | S100126 | |
| XMU-MP-1 | Targetmol | T4212 | |
| 流变学测量 | 流变仪MCR302 | Anton Paar | -- |
| Micro-CT扫描 | X射线显微分析仪SkyScan1272 | Bruker | -- |
| 3D生物打印 | 定制3D注射泵挤出系统 | -- | -- |
| SEM | 扫描电子显微镜Quanta Feg 250 | -- | -- |
| 组织切片染色 | 脱水机Donatello | DIAPATH | -- |
| 包埋机JB-P5 | Junjie | -- | |
| 病理切片机RM2016 | Leica | -- | |
| 光学显微镜UB200i | UOP | -- | |
| 质构分析 | 质构分析仪Universal TA | Shanghai Tengba Instrument Co., Ltd. | -- |
| 低场核磁共振 | 核磁共振分析仪NMI20-015V-I | Niumag Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分离与培养 | PSCs分离使用0.1% IV型胶原酶消化1小时和0.1%胰蛋白酶-EDTA消化20分钟，PADSCs使用0.1% I型胶原酶消化1小时；增殖培养基成分和培养温度需确认 阅读提示：详见Methods 'Isolation and culture of PSCs and PADSCs' |
| 成肌分化 | 基础分化培养基为F12+8%马血清+10 ng/mL IGF-1+50 nM necrosulfonamide+200 μM抗坏血酸，高效分化需添加5 μM RepSox和10 nM LY411575，并加入等体积含8% FBS和200 nM地塞米松的DMEM 阅读提示：详见Methods 'Myogenic differentiation' 和 'High efficiency myogenic differentiation' |
| 3D支架制备 | 材料为10%鱼明胶/1%海藻酸钠，需在70°C搅拌3小时制备前驱液，PSCs浓度为5×10^6 cells/mL，CaCl2固化条件为1%浓度10分钟 阅读提示：详见Methods '3D cell culture' 和 '3D bioprinting' |
| 3D打印参数 | 打印使用400 μm内径锥形针头，每层17条凝胶纤维，其中6条倾斜30°，共打印10层，具体参数见补充表S1 阅读提示：详见Methods '3D bioprinting' 和补充表S1 |
| 培养与表征 | 打印后支架在增殖培养基中培养10天，再在分化培养基中培养7天；最终鱼片尺寸为20×12×4 mm，需进行细胞计数、HE染色、质构分析和LF-NMR 阅读提示：详见Results 'Muscle tissue formation under guidance of biomimetic model of scaffold' 和 'Characterization of tissue-like cultured fish fillets' |