NPC的分离与培养
获得不同年龄的髓核细胞用于后续实验。
从ADS-IVDD患者中分离髓核组织,通过酶消化法原代培养Y-NPC和O-NPC,并购买正常N-NPC。
Overloaded axial stress activates the Wnt/β-Catenin pathway in nucleus pulposus cells of adult degenerative scoliosis combined with intervertebral disc degeneration.
包含体外细胞实验,涉及原代培养、轴向应力处理、增殖凋亡检测和蛋白/mRNA表达分析,但缺乏动物或体内验证。
正常髓核细胞(N-NPC) 年轻ADS-IVDD患者髓核细胞(Y-NPC) 年老ADS-IVDD患者髓核细胞(O-NPC)
轴向应力处理条件:1 mPa压力,每天两次,每次2小时,持续7天 NPC类型:正常、年轻和年老ADS-IVDD患者来源 细胞活力检测时间点:0、12、24、48、72小时 凋亡检测方法:Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术 Wnt/β-Catenin通路蛋白和mRNA表达检测
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获得不同年龄的髓核细胞用于后续实验。
从ADS-IVDD患者中分离髓核组织,通过酶消化法原代培养Y-NPC和O-NPC,并购买正常N-NPC。
确认分离细胞的类型和状态。
通过甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖合成能力,通过Western blot检测II型胶原和Aggrecan表达。
模拟过载轴向应力对NPC的影响。
使用FX-5000C™ Compression System对N-NPC和Y-NPC施加轴向应力。
评估轴向应力对NPC增殖的影响。
使用CCK-8试剂盒检测细胞活力。
评估轴向应力对NPC凋亡的影响。
使用Annexin V-FITC/PI试剂盒和流式细胞术检测凋亡率。
检测Wnt/β-Catenin通路相关蛋白和mRNA的表达水平。
使用Western blot检测Wnt 3a、β-Catenin、凋亡相关蛋白,使用RT-qPCR检测Wnt 3a和β-Catenin mRNA表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 0.25%胰蛋白酶 | Solarbio | -- | |
| 0.2% II型胶原酶 | Solarbio | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | ZSGB-Bio | -- | |
| 鉴定 | 甲苯胺蓝染色液 | Solarbio | -- |
| 轴向应力处理 | FX-5000C™压缩系统 | Flexcell International | -- |
| 1.2%海藻酸钠溶液 | Aladdin | -- | |
| 氯化钙溶液 | Aladdin | -- | |
| 氯化钠溶液 | Aladdin | -- | |
| 增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 脱脂奶粉 | Wondersun | -- | |
| 兔抗Wnt3a抗体 | Bioss | bs-1700R | |
| 兔抗β-Catenin单克隆抗体 | Abcam | ab32572 | |
| 兔抗Caspase-3单克隆抗体 | Abcam | ab184787 | |
| 兔抗Bcl-2多克隆抗体 | Abcam | ab196495 | |
| 兔抗Bax单克隆抗体 | Abcam | ab182733 | |
| 小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体 | ZSGB-BIO | TA-09 | |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP | Abmart | M21001L | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Abmart | M21002L | |
| ECL底物试剂盒 | Abcam | -- | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Life Technologies | -- |
| FastKing RT试剂盒(含gDNase) | TIANGEN | -- | |
| Taq Pro通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| 7500实时荧光定量PCR系统 | ABI | -- | |
| 检测 | ELX800酶标仪 | Biotech | -- |
| 流式 | Novocyte Advanteon流式细胞仪 | Agilent | -- |
| Western blot | EzDrop1000紫外分光光度计 | BLUE-RAY | -- |
| SLK-R3000-S摇床 | Scilogex | -- | |
| 5200-multi凝胶成像系统 | Tanon | -- | |
| 细胞培养 | BX53光学显微镜 | Olympus | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NPC分离与培养 | 患者年龄范围(25-30岁和65-70岁)、组织来源、消化酶浓度和时间(0.25%胰蛋白酶20-30分钟,0.2% II型胶原酶4小时)、细胞密度(1×10^5/ml)、培养条件(DMEM/F12,5% CO2,37°C)、传代次数(P3) 阅读提示:Materials and methods: Primary culture and identification of NPC |
| 轴向应力处理 | 压力值(1 mPa)、频率(每天两次)、持续时间(每次2小时,共7天)、细胞密度(2×10^5/孔)、凝胶珠制备条件(1.2%海藻酸钠,0.1 mol/L CaCl2) 阅读提示:Materials and methods: Axial stress treatment |
| 细胞增殖检测 | 细胞密度(5×10^5/ml)、检测时间点(0, 12, 24, 48, 72小时)、CCK-8孵育时间(4小时)、检测波长(450 nm) 阅读提示:Materials and methods: Cell proliferation and apoptosis assay |
| 细胞凋亡检测 | FITC和PI的体积(5 μl和10 μl)、孵育时间(15分钟和5分钟)、流式细胞仪型号 阅读提示:Materials and methods: Cell proliferation and apoptosis assay |
| Western blot | 抗体稀释比例(如Wnt3a 1:3000, β-catenin 1:7000等)、封闭条件(5%脱脂奶粉,室温4小时)、一抗孵育(4°C过夜)、二抗孵育(室温2小时) 阅读提示:Materials and methods: Western blotting assay |
| RT-qPCR | 引物序列、反应体系(SYBR 5 μl,引物各0.25 μl,cDNA 1 μl,水3.5 μl)、热循环条件(95°C 1分钟,60°C 1分钟,72°C 30秒,35个循环) 阅读提示:Materials and methods: RT-qPCR assay |