过载轴向应力激活成人退变性脊柱侧凸合并椎间盘退变中髓核细胞的Wnt/β-Catenin通路

Overloaded axial stress activates the Wnt/β-Catenin pathway in nucleus pulposus cells of adult degenerative scoliosis combined with intervertebral disc degeneration.

作者信息Zhijun Cai, Qibiao Luo, Xi Yang, Luqiao Pu, Haiyang Zong, Rongmao Shi, Pengju He, Yongqing Xu, Yang Li, Jianping Zhang
PMID37031322
发布时间2023-06
DOI10.1007/s11033-023-08390-9

实验完整度

包含体外细胞实验,涉及原代培养、轴向应力处理、增殖凋亡检测和蛋白/mRNA表达分析,但缺乏动物或体内验证。

主要模型

正常髓核细胞(N-NPC) 年轻ADS-IVDD患者髓核细胞(Y-NPC) 年老ADS-IVDD患者髓核细胞(O-NPC)

重点核对

轴向应力处理条件:1 mPa压力,每天两次,每次2小时,持续7天 NPC类型:正常、年轻和年老ADS-IVDD患者来源 细胞活力检测时间点:0、12、24、48、72小时 凋亡检测方法:Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术 Wnt/β-Catenin通路蛋白和mRNA表达检测

摘要

背景:椎间盘退变(IVDD)是成人退变性脊柱侧凸(ADS)的始动因素,而ADS进一步加速IVDD,形成恶性循环。然而,Wnt/β-Catenin通路在ADS合并IVDD(ADS-IVDD)中的作用仍不清楚。因此,本研究旨在探讨轴向应力对从DS-IVDD患者分离的髓核细胞(NPCs)中Wnt/β-Catenin通路的影响。方法:购买正常NPC(N-NPC),并原代培养来自ADS-IVDD患者的年轻(25-30岁;Y-NPC)和年老(65-70岁;O-NPC)NPC。经过载轴向压力处理后,采用CCK-8和Annexin V-FITC试剂盒检测N-NPC、Y-NPC和O-NPC的增殖和凋亡,并通过Western blotting评估Wnt 3a、β-Catenin、NPC标志物和凋亡标志物(Bax、Bcl2和Caspase 3)的表达。结果:N-NPC、Y-NPC和O-NPC主要呈椭圆形、多边形和梭形,带有伪足,细胞形态随年龄增长趋于扁平。N-NPC、Y-NPC和O-NPC能够合成蛋白聚糖并表达NPC标志物(II型胶原和Aggrecan)。值得注意的是,Wnt 3a、β-Catenin、II型胶原和Aggrecan的表达在N-NPC、Y-NPC和O-NPC中依次降低。过载轴向应力处理后,N-NPC和Y-NPC的细胞活力显著降低,凋亡百分比及Wnt 3a和β-Catenin的表达显著增加。结论:过载轴向压力激活Wnt/β-Catenin通路,抑制ADS-IVDD患者NPC的增殖并促进其凋亡。补充信息:在线版本包含补充材料,可访问10.1007/s11033-023-08390-9。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
轴向应力是否通过调节Wnt/β-Catenin通路影响ADS-IVDD患者髓核细胞的增殖和凋亡?
核心机制
过载轴向应力激活Wnt/β-Catenin通路,抑制髓核细胞增殖并促进其凋亡。
主要证据
在N-NPC和Y-NPC中,轴向应力处理后细胞活力显著降低,凋亡率增加,Wnt 3a和β-Catenin的蛋白和mRNA表达升高。
研究意义
为未来ADS-IVDD的预防和治疗提供了理论基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

NPC的分离与培养

获得不同年龄的髓核细胞用于后续实验。

从ADS-IVDD患者中分离髓核组织,通过酶消化法原代培养Y-NPC和O-NPC,并购买正常N-NPC。

2

NPC鉴定与特征分析

确认分离细胞的类型和状态。

通过甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖合成能力,通过Western blot检测II型胶原和Aggrecan表达。

3

轴向应力处理

模拟过载轴向应力对NPC的影响。

使用FX-5000C™ Compression System对N-NPC和Y-NPC施加轴向应力。

4

细胞增殖检测

评估轴向应力对NPC增殖的影响。

使用CCK-8试剂盒检测细胞活力。

5

细胞凋亡检测

评估轴向应力对NPC凋亡的影响。

使用Annexin V-FITC/PI试剂盒和流式细胞术检测凋亡率。

6

蛋白和mRNA表达分析

检测Wnt/β-Catenin通路相关蛋白和mRNA的表达水平。

使用Western blot检测Wnt 3a、β-Catenin、凋亡相关蛋白,使用RT-qPCR检测Wnt 3a和β-Catenin mRNA表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM/F12培养基Thermo Fisher Scientific--
0.25%胰蛋白酶Solarbio--
0.2% II型胶原酶Solarbio--
磷酸盐缓冲液ZSGB-Bio--
甲苯胺蓝染色液Solarbio--
FX-5000C™压缩系统Flexcell International--
1.2%海藻酸钠溶液Aladdin--
氯化钙溶液Aladdin--
氯化钠溶液Aladdin--
CCK-8试剂盒Dojindo--
Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒Solarbio--
RIPA裂解液Beyotime--
PVDF膜----
脱脂奶粉Wondersun--
兔抗Wnt3a抗体Biossbs-1700R
兔抗β-Catenin单克隆抗体Abcamab32572
兔抗Caspase-3单克隆抗体Abcamab184787
兔抗Bcl-2多克隆抗体Abcamab196495
兔抗Bax单克隆抗体Abcamab182733
小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体ZSGB-BIOTA-09
山羊抗小鼠IgG-HRPAbmartM21001L
山羊抗兔IgG-HRPAbmartM21002L
ECL底物试剂盒Abcam--
Trizol试剂Life Technologies--
FastKing RT试剂盒(含gDNase)TIANGEN--
Taq Pro通用SYBR qPCR预混液Vazyme--
7500实时荧光定量PCR系统ABI--
ELX800酶标仪Biotech--
Novocyte Advanteon流式细胞仪Agilent--
EzDrop1000紫外分光光度计BLUE-RAY--
SLK-R3000-S摇床Scilogex--
5200-multi凝胶成像系统Tanon--
BX53光学显微镜Olympus--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
NPC分离与培养
患者年龄范围(25-30岁和65-70岁)、组织来源、消化酶浓度和时间(0.25%胰蛋白酶20-30分钟,0.2% II型胶原酶4小时)、细胞密度(1×10^5/ml)、培养条件(DMEM/F12,5% CO2,37°C)、传代次数(P3)
阅读提示:Materials and methods: Primary culture and identification of NPC
轴向应力处理
压力值(1 mPa)、频率(每天两次)、持续时间(每次2小时,共7天)、细胞密度(2×10^5/孔)、凝胶珠制备条件(1.2%海藻酸钠,0.1 mol/L CaCl2)
阅读提示:Materials and methods: Axial stress treatment
细胞增殖检测
细胞密度(5×10^5/ml)、检测时间点(0, 12, 24, 48, 72小时)、CCK-8孵育时间(4小时)、检测波长(450 nm)
阅读提示:Materials and methods: Cell proliferation and apoptosis assay
细胞凋亡检测
FITC和PI的体积(5 μl和10 μl)、孵育时间(15分钟和5分钟)、流式细胞仪型号
阅读提示:Materials and methods: Cell proliferation and apoptosis assay
Western blot
抗体稀释比例(如Wnt3a 1:3000, β-catenin 1:7000等)、封闭条件(5%脱脂奶粉,室温4小时)、一抗孵育(4°C过夜)、二抗孵育(室温2小时)
阅读提示:Materials and methods: Western blotting assay
RT-qPCR
引物序列、反应体系(SYBR 5 μl,引物各0.25 μl,cDNA 1 μl,水3.5 μl)、热循环条件(95°C 1分钟,60°C 1分钟,72°C 30秒,35个循环)
阅读提示:Materials and methods: RT-qPCR assay