利用周围环绕浅水的不稳定平台建立睡眠碎片化慢性失眠大鼠模型

Establishment of a chronic insomnia rat model of sleep fragmentation using unstable platforms surrounded by water.

作者信息De-Qi Yan, Xing-Ping Zhang, Wen-Hui Zhang, Ning Deng, Zheng-Ting Liang, Tao Liu, Guan-Ying Wang, Qian-Wei Yao, Kai-Kai Wang, Zhen-Peng Tong
PMID37114171
发布时间2023-04
DOI10.3892/etm.2023.11932

实验完整度

中

实验包括动物模型建立、行为学测试(Morris水迷宫、戊巴比妥诱导睡眠)、睡眠监测(EEG/EMG)、分子检测(ELISA、免疫组化、免疫荧光),但缺乏独立的功能验证或机制验证,且样本量小。

主要模型

雄性Sprague-Dawley大鼠(慢性失眠模型)

重点核对

睡眠碎片化诱导装置:多串不稳定平台,周围环绕1.5cm深浅水 模型持续时间:6周(除每周第一天外) 戊巴比妥钠剂量:35 mg/kg 腹腔注射 睡眠监测时间:第46天,6:00至18:00和18:00至次6:00 样本量:每组12只(行为学),每组6只(睡眠监测)

摘要

慢性碎片化睡眠是一种非常常见的失眠类型,影响着全球许多人的日常生活。然而,其发病机制尚不完全清楚,目前也尚未见用于此目的的相应大鼠模型。本研究旨在利用自制多串不稳定平台(周围环绕浅水)建立伴有睡眠碎片化的慢性失眠大鼠模型。在模型建立过程中,记录了大鼠的体重变化以及白天和夜间食物和饮水摄入的差异。通过多项测试评估了大鼠模型,包括Morris水迷宫测试、戊巴比妥钠诱导睡眠、红外监测以及睡眠期间的脑电图/肌电图。采用ELISA、免疫组织化学和免疫荧光法检测血清和脑组织中某些炎症因子和食欲素A的表达水平。还检测了脑中食欲素1受体(orexin 1r)的表达水平。多导睡眠图显示,模型大鼠制备成功,表现为白天非快速眼动(non-REM)睡眠减少,夜间增加,白天和夜间REM持续时间显著降低。白天和夜间的觉醒次数也增加,白天每次睡眠发作的平均持续时间减少。模型大鼠的体重以正常速度增长。然而,白天体重的减轻和夜间体重的增加均显著小于对照大鼠。模型大鼠白天的食物和饮水消耗量较对照组显著增加,但夜间与对照组相似。Morris水迷宫测试表明,模型大鼠学习逃离平台的速度较慢,穿越目标区域的次数较少。戊巴比妥诱导的睡眠实验证实,模型大鼠表现出更长的睡眠潜伏期和更短的睡眠时间。与对照大鼠相比,模型大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和食欲素A水平显著升高,而血清IL-10水平显著降低。模型大鼠脑组织中IL-1β、IL-6、食欲素A和orexin 1r的表达水平也显著升高。总之,这些数据表明,模型大鼠的学习和记忆功能、睡眠时间、觉醒次数、昼夜体重变化、食物和水摄入量以及特定炎症因子食欲素A和orexin 1r的表达水平均发生了改变。这表明使用多串不稳定平台(周围环绕水)成功建立了伴有睡眠碎片化的慢性失眠大鼠模型。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
本研究旨在建立一种慢性睡眠碎片化失眠大鼠模型,并评估其行为、生理和分子变化,以研究慢性失眠的机制。
核心机制
睡眠碎片化导致炎症因子(IL-1β, IL-6, TNF-α)升高和抗炎因子IL-10降低,同时食欲素A及orexin 1r表达增加,可能与认知功能障碍和睡眠紊乱有关。
主要证据
模型大鼠表现出非快速眼动睡眠白天减少、夜间增加,REM睡眠减少,学习记忆障碍,对戊巴比妥诱导睡眠抵抗,血清和脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、食欲素A及orexin 1r表达增加,IL-10降低。
研究意义
该模型可用于研究慢性睡眠碎片化失眠的机制,为失眠的进一步研究提供依据。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立慢性失眠模型

利用不稳定平台引起睡眠碎片化,建立慢性失眠大鼠模型。

将大鼠随机分为对照组和模型组,每组12只。模型组饲养在含多串不稳定平台的笼中,平台周围有浅水(1.5cm深),持续6周(每周第一天除外)。

2

评估一般状况和体重变化

监测模型大鼠的体重、食物和饮水摄入变化。

每周第一天测量体重和食物/水摄入量,分别在6:00和18:00以及次日6:00进行,评估白天和夜间的变化。

3

评估学习和记忆功能

通过Morris水迷宫测试评估模型大鼠的学习和记忆能力。

在第37-41天的晚上进行Morris水迷宫训练和测试,记录逃避潜伏期和穿越目标区域的次数。

4

评估戊巴比妥钠诱导的睡眠

评估模型大鼠对催眠药物的反应,验证模型大鼠的睡眠障碍。

在第43天,腹腔注射35 mg/kg戊巴比妥钠,记录睡眠潜伏期和睡眠时间。

5

睡眠监测(EEG/EMG)

通过多导睡眠图监测评估模型大鼠的睡眠结构和觉醒情况。

在第44天,随机选择每组6只大鼠,在麻醉下用立体定位仪固定2EEG/1 EMG头套,第46天连接放大器监测睡眠,从6:00至18:00和18:00至次日6:00,并辅以红外监测。

6

样本采集和分子检测

检测血清和脑组织中炎症因子和食欲素A及orexin 1r的表达,探索睡眠碎片化的分子机制。

在第44天上午,对每组其余6只非睡眠监测大鼠麻醉后采集腹主动脉血,随后处死取脑。血液离心获取血清,脑组织固定后切片,进行ELISA、免疫组化和免疫荧光检测。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
IL-1β ELISA试剂盒Sigma-Aldrich (Merck KGaA)RAB0277
IL-6 ELISA试剂盒Sigma-Aldrich (Merck KGaA)RAB0311
TNF-α ELISA试剂盒Sigma-Aldrich (Merck KGaA)RAB0479
IL-10 ELISA试剂盒Abcamab214566
Orexin A ELISA试剂盒SinobestbioYX-E28754
IL-1β抗体BIOSSbs-0812R
IL-6抗体BIOSSbs-4539R
Orexin A抗体BIOSSbs-15509R
Orexin 1r抗体BIOSSbs-18029R
二抗试剂盒BIOSSSP-2003
辣根过氧化物酶-IgGRecordbioRCA015
TYR-CY3染料RecordbioRCA019
TCR-488染料RecordbioRCF020
抗荧光衰减封片剂Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.s2100
中性树胶Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.G8590
DAB显色液Origene Technologies, Inc.ZLI-9018
Morris水迷宫设备Chengdu Taimeng Science and Technology Co., Ltd.WMT-100
低速冷冻离心机Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd.KDC-2044
超速离心机EppendorfHimac
荧光显微镜Leica Microsystems, Inc.DMi8
酶标仪Thermo Fisher Scientific, Inc.Multiskan™
立体定位仪数字脑立体定位仪公司--
睡眠监测仪器(2脑电/1肌电头套)Pinnacle Technology, Inc.--
红外监控器TP-Link Technologies Co., Ltd.--
Image-Pro Plus 6.0软件Media Cybernetics, Inc.--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物与饲养
雄性SD大鼠,8-9周龄,体重200-240g;每笼3只;光照周期12h/12h;温度23±2℃;湿度40-60%
阅读提示:详见Materials and methods中的Animals部分
模型建立
平台规格:直径5cm,高3cm,不锈钢丝直径3mm;浅水深度1.5cm;模型持续6周(每周第一天除外)
阅读提示:详见Materials and methods中的Animal grouping and modeling部分
行为学测试
Morris水迷宫训练和测试在第37-41天晚上进行;戊巴比妥钠剂量35mg/kg腹腔注射,在第43天进行
阅读提示:详见Materials and methods中的Learning and memory function assessment及Pentobarbital sodium-induced sleep experiment部分
睡眠监测
每组6只大鼠;使用2EEG/1EMG头套;在第44天植入,第46天监测;监测时间6:00-18:00和18:00-次日6:00
阅读提示:详见Materials and methods中的Sleep monitoring部分
分子检测
血清采集:腹主动脉采血,离心3000g 15min;脑组织固定于4%多聚甲醛3天;ELISA、免疫组化、免疫荧光检测炎症因子和orexin A/orexin 1r
阅读提示:详见Materials and methods中的Sample collection、ELISA、Immunohistochemical detection及Immunofluorescence detection部分