地奥司明纳米晶凝胶通过调节TLR7,8/NF-κB/micro RNA-31、AKT/mTOR/P70S6K环境和Tregs/Th17平衡减轻咪喹莫特诱导的大鼠银屑病

Diosmin nanocrystal gel alleviates imiquimod-induced psoriasis in rats via modulating TLR7,8/NF-κB/micro RNA-31, AKT/mTOR/P70S6K milieu, and Tregs/Th17 balance.

作者信息Yasmine Shahine, Sarah A Abd El-Aal, Ahmed M Reda, Eman Sheta, Nouran M Atia, Ossama Y Abdallah, Sherihan Salaheldin Abdelhamid Ibrahim
PMID37010718
发布时间2023-06
DOI10.1007/s10787-023-01198-w

实验完整度

高

包含纳米晶制备与表征、体外释放研究、动物模型(咪喹莫特诱导大鼠银屑病)及多种机制验证(Western blot、qRT-PCR、组织病理、免疫组化),并进行功能验证。

主要模型

Sprague-Dawley大鼠(雌性,12-14周龄) 咪喹莫特诱导的银屑病大鼠模型

重点核对

地奥司明纳米晶制剂(F2)的粒径(276.9 nm)及稳定性 地奥司明纳米晶凝胶的给药剂量(4.8, 9.6, 19.2 mg/day/rat) 咪喹莫特给药方案(125 mg 5% IMQ连续5天) PASI评分评估时间点(第0, 5, 12日)

摘要

地奥司明是一种具有抗炎和抗氧化特性的黄酮类化合物。然而,其溶解度需要pH 12,这影响了药物的生物利用度,因此其理化特性较为困难。本研究旨在通过反溶剂沉淀技术开发并表征地奥司明纳米晶,用于银屑病的局部治疗。结果表明,用羟丙基甲基纤维素(HPMC E15)以(地奥司明:聚合物;1:1)比例稳定的地奥司明纳米晶达到了所需的粒径(276.9 ± 16.49 nm);提供了有前景的胶体性质并具有高药物释放特性。此外,进行了体内评估,以评估和比较三种不同剂量的地奥司明纳米晶凝胶和地奥司明粉末凝胶在减轻咪喹莫特诱导的大鼠银屑病方面的活性,并研究其可能的抗炎机制。在此,将125 mg的5%咪喹莫特乳膏(IMQ)局部涂抹在大鼠剃毛的背部,连续5天以诱导银屑病。地奥司明纳米晶凝胶,尤其是使用的最高剂量,提供了最佳的抗炎效果。这通过引起银屑病面积严重程度指数(PASI)评分和血清炎症细胞因子水平最显著的统计学降低得到证实。此外,它能够维持辅助性T细胞(Th17)和调节性T细胞(Treg)之间的平衡。此外,它处理了TLR7/8/NF-κB、miRNA-31、AKT/mTOR/P70S6K,并提高了银屑病皮肤组织中TNFAIP3/A20(NF-κB的负调节因子)的表达。这凸显了地奥司明纳米晶凝胶在减轻咪喹莫特诱导的大鼠银屑病中的作用,因此它可能成为治疗银屑病的一种新的有前景的疗法。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
地奥司明纳米晶凝胶能否通过调节TLR7,8/NF-κB/microRNA-31和AKT/mTOR/P70S6K通路及Tregs/Th17平衡来减轻咪喹莫特诱导的大鼠银屑病?
核心机制
地奥司明纳米晶凝胶抑制TLR7/8/NF-κB通路,降低miR-31表达,抑制AKT/mTOR/P70S6K信号,恢复Tregs/Th17平衡,并上调TNFAIP3/A20(NF-κB负调节因子)表达。
主要证据
动物实验显示,最高剂量地奥司明纳米晶凝胶(19.2 mg/day)显著降低PASI评分和血清IL-17A、IL-22、IL-23水平,Western blot证实TLR7/8、p-NF-κB、p-AKT、p-mTOR、P70S6K、PCNA、BCL2表达降低,TNFAIP3表达升高;qRT-PCR显示miR-31显著下调;组织病理显示表皮厚度减少,免疫组化显示FOXP3+ Treg增多,RORγ+ Th17减少。
研究意义
该研究提出地奥司明纳米晶凝胶可作为治疗银屑病的潜在新型疗法。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

地奥司明纳米晶的制备与表征

优化地奥司明纳米晶的制备工艺,以获得粒径小、稳定性高的制剂,并确定最佳处方。

采用反溶剂沉淀法制备地奥司明纳米晶,使用不同稳定剂(HPMC E15、MC、Poloxamer 407)及不同比例,通过Malvern Zetasizer测量粒径和PDI,通过光学显微镜观察晶体形态,通过TEM观察形态,通过FT-IR和XRD分析药物与稳定剂相互作用及结晶度,并通过体外释放研究评估释放特性。

2

地奥司明纳米晶凝胶的制备与表征

将优化的纳米晶制剂制备成凝胶,并评估凝胶形成对粒径和释放行为的影响。

使用2%海藻酸钠增稠F2纳米晶分散体制备凝胶,测定凝胶中粒径,并在32°C下进行体外释放研究。

3

体内药效学评估

评估地奥司明纳米晶凝胶不同剂量对咪喹莫特诱导银屑病大鼠的治疗效果。

建立IMQ诱导大鼠银屑病模型,将48只雌性SD大鼠随机分为6组,给予不同处理,评估PASI评分、血清炎症因子、皮肤组织病理及免疫组化。

4

分子机制研究

探讨地奥司明纳米晶凝胶对银屑病相关信号通路和免疫细胞平衡的影响。

采用Western blot检测TLR7/8、NF-κB p65、AKT、mTOR、P70S6K、TNFAIP3、PCNA、BCL2蛋白表达,qRT-PCR检测miR-31表达,ELISA检测血清细胞因子,免疫组化检测FOXP3和RORγ表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
地奥司明Jianshi Yuantong Bioengineering Co., Ltd--
羟丙基甲基纤维素(HPMC E15)Zhengzhou Tianying Chemicals Company--
甲基纤维素Zhengzhou Tianying Chemicals Company--
泊洛沙姆407(Kolliphore 407)BASF--
海藻酸钠Qingdao Lanneret Biochemical Co., Ltd.--
二甲基亚砜Oxford chemicals--
透析管,Visking® 36/32,28 mm,MWCO 12,000–14,000Serva--
艾达乐乳膏(5%咪喹莫特)Meda Pharmaceuticals--
大鼠IL-17A ELISA试剂盒Abcamab214028
大鼠IL-23 ELISA试剂盒InvitrogenERA28RB
大鼠IL-22 ELISA试剂盒InvitrogenERA27RB
抗PCNA抗体Abcamab152112
抗BCL2抗体Abcamab196495
抗磷酸化AKT (T308)抗体Abcamab38449
抗磷酸化mTOR (Ser2448)抗体Cell Signaling Technology2971
抗磷酸化P70S6K (Thr389)抗体Cell Signaling Technology9205
抗TNFAIP3 (A20)抗体InvitrogenPA5-20729
抗TLR7抗体InvitrogenPA1-28109
抗TLR8抗体Abcamab180610
抗NF-κB p65(磷酸化Ser468)抗体InvitrogenPA5-35597
TRIzol Plus RNA纯化试剂盒Invitrogen12183555
Superscript一步法RT-PCR系统Invitrogen12594100
FOXP3单克隆抗体Thermo Fisher Scientific14-5773-82
RORγ多克隆抗体Biossbs-6217R

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
纳米晶制备
地奥司明与稳定剂(HPMC E15)的比例(1:1)以及搅拌速度(500 rpm)和搅拌时间(30 min)
阅读提示:Materials and methods, Part 1, 'Method of preparation of diosmin nanocrystals'
动物模型建立
大鼠品系、性别、周龄、体重,以及咪喹莫特乳膏的使用剂量(5%,125 mg)和给药时间(连续5天)
阅读提示:Materials and methods, Part 2, 'Animals' 和 'Induction and experimental groups'
治疗给药方案
地奥司明纳米晶凝胶的剂量(4.8, 9.6, 19.2 mg/day/rat)和给药体积(2 ml)以及给药时间(连续7天)
阅读提示:Materials and methods, Part 2, 'Induction and experimental groups'
分子检测
Western blot抗体信息(如TLR7, NF-κB等)及qRT-PCR引物序列(miR-31, β-actin)
阅读提示:Materials and methods, Table 1 和 Table 2