FBR模型诱导衰老并验证p16表达
验证PCL植入诱导肌肉伤口纤维化并富集衰老细胞
将PCL颗粒植入小鼠股四头肌，在1周和6周后通过qPCR检测Cdkn2a表达，并分离CD45-CD31-CD29+基质细胞进行表达分析
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生物材料纤维化模型中的迁移学习识别体内衰老异质性及其对跨物种和多种病理中血管化和基质产生的贡献
Transfer learning in a biomaterial fibrosis model identifies in vivo senescence heterogeneity and contributions to vascularization and matrix production across species and diverse pathologies.
实验完整度
高包含体内报告小鼠模型、体外共培养验证、多个scRNAseq数据集迁移学习分析、信号通路预测与正交实验验证等至少两个独立证据层级。
主要模型
p16-EF/CreERT2;Ai14报告小鼠的异物反应纤维化模型 人乳腺假体纤维包膜组织 人特发性肺纤维化（IPF）scRNAseq数据集 人基底细胞癌（BCC）scRNAseq数据集
重点核对
p16-EF/CreERT2;Ai14小鼠中tdTom报告基因的诱导时间（术后4-5周连续5天注射他莫昔芬） FBR模型中使用的生物材料类型（PCL颗粒，剂量30mg） 单细胞测序平台（Drop-Seq）及数据整合方法（Harmony） 迁移学习评分所依据的差异表达基因集（FDR<0.05）
摘要
细胞衰老是一种永久性生长停滞状态，在伤口愈合、组织纤维化和肿瘤抑制中发挥重要作用。尽管衰老细胞（SnCs）具有病理作用和治疗意义，但其体内表型仍不清楚。在此，我们利用p16-CreERT2;Ai14报告小鼠中的异物反应驱动的纤维化模型，开发了一种体内衍生的衰老特征（SenSig）。我们鉴定出周细胞和“软骨样”成纤维细胞为衰老细胞，并定义了细胞类型特异性的衰老相关分泌表型（SASPs）。迁移学习和衰老评分在来自不同病理的新的和公开可用的小鼠和人类数据单细胞RNA测序（scRNAseq）数据集中识别出这两个SnC群体以及内皮和上皮SnCs。信号分析揭示了SnCs与髓系细胞之间通过IL34–CSF1R–TGFβR信号轴的串扰，有助于血管化和基质产生的组织平衡。总体而言，我们的研究提供了衰老特征和计算方法，可广泛应用于识别伤口愈合、衰老和其他病理中的SnC转录谱和SASP因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 体内衰老细胞的表型异质性及其在血管化和基质产生中的功能尚不清楚。
- 核心机制
- SnCs通过IL34-CSF1R-TGFβR信号轴与髓系细胞相互作用，调节组织血管化和基质产生的平衡。
- 主要证据
- p16报告小鼠体内FBR模型、批量RNA-seq生成SenSig、迁移学习识别多种病理中SnC群体、Domino预测及体外共培养验证IL34-CSF1R-TGFβR轴。
- 研究意义
- 提供可广泛应用的衰老特征和计算方法，以识别伤口愈合、衰老及其他病理中的衰老细胞及其SASP因子。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建p16报告小鼠并验证
验证p16-EF/CreERT2;Ai14报告小鼠能准确标记p16+衰老细胞
通过同源重组生成p16-EF/CreERT2小鼠，与Ai14杂交，用4-OHT处理MEFs验证Cre功能，并通过传代和γ照射诱导衰老验证tdTom表达
体内标记并分选p16+衰老细胞
在FBR纤维化组织中标记并定量p16+细胞
术后4-5周连续5天腹腔注射他莫昔芬，6周后通过免疫荧光和流式细胞术检测tdTom+细胞，并鉴定其亚群
批量RNA-seq鉴定衰老特征
获得体内衰老基质细胞的转录组特征
分选tdTom+和tdTom-基质细胞进行批量RNA测序，鉴定差异表达基因，并通过GSEA和IPA分析通路
单细胞RNA-seq构建基质异质性图谱
解析FBR纤维化中基质细胞的异质性
分选CD45-CD31-CD29+细胞进行Drop-seq，分析不同时间点和处理组的聚类和分化轨迹
迁移学习识别SnC群体
验证SenSig能识别scRNAseq中的衰老细胞
将SenSig应用于FBR基质scRNAseq数据，识别高SenSig细胞簇（周细胞和纤维化成纤维细胞），并比较体内与体外来源的特征
跨物种验证
验证SenSig能跨物种和病理识别衰老细胞
将SenSig映射到人类乳腺包膜、IPF和BCC的scRNAseq数据，识别高SenSig细胞簇并通过免疫荧光验证
细胞间信号分析
预测SnC与其他细胞类型的相互作用
分析CD45+富集的scRNAseq数据，用Domino预测信号网络，重点关注SnC与髓系细胞的相互作用
体外共培养验证信号轴
验证IL34-CSF1R-TGFβR信号轴
将衰老成纤维细胞与巨噬细胞共培养，检测Il34、Csf1r、Tgfb1、Il1b等表达，并通过GSEA验证下游转录因子靶基因
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| FBR模型诱导 | 聚己内酯（PCL） | Polysciences | -- |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | -- | -- |
| 卡洛芬 | Rimadyl Zoetis | -- | |
| MEF培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma | -- | |
| Western blot | p16一抗 | Santa Cruz | sc-1207 |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Jackson Immunoresearch | -- | |
| 细胞培养 | Liberase（胶原酶） | Roche | -- |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Miltenyi Biotech | -- | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | -- | |
| Transwell膜 | Corning | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RNeasy微型试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| RNeasy微型试剂盒 | Qiagen | 74004 | |
| cDNA合成 | SuperScript VILO反转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SuperScript III第一链合成系统 | Invitrogen | 18080051 | |
| qPCR | TaqMan探针 | -- | -- |
| SYBR Green实时PCR预混液 | Applied Biosystems | 4309155 | |
| StepOne Plus实时PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA-seq | TruSeq RNA文库制备试剂盒V2 | Illumina | -- |
| 安捷伦BioAnalyzer | Agilent | -- | |
| 组织处理 | 伊红Y溶液 | Sigma-Aldrich | HT110216 |
| Permount封片剂 | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Bouin固定液 | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 比布里希猩红-酸性品红 | Sigma-Aldrich | HT15-1 | |
| 磷钼酸/磷钨酸混合物 | Sigma-Aldrich | HT15-3 and HT15-2 | |
| 苯胺蓝溶液 | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| 免疫荧光 | 人p16INK4a抗体 | CINTEC-Roche | 705-4793 |
| 人αSMA抗体 | Abcam | ab124964 | |
| 人CD68抗体 | Abcam | ab955 | |
| 人FAP抗体 | Abcam | ab218164 | |
| 人CD31抗体 | Abcam | ab76533 | |
| 小鼠p16INK4a抗体 | Abcam | ab211542 | |
| 小鼠CD31抗体 | Abcam | ab182981 | |
| 小鼠Fibromodulin抗体 | Bioss | 12362R | |
| 小鼠F4/80抗体 | eBioscience | 14-4801-82 | |
| Opal 520荧光染料 | Akoya | FP1487001KT | |
| Opal 570荧光染料 | Akoya | FP1488001KT | |
| Opal 650荧光染料 | Akoya | FP1496001KT | |
| DAPI | -- | -- | |
| DAKO封片剂 | Agilent | S302380-2 | |
| Axio Imager.A2显微镜 | Carl Zeiss Microscopy | 490022-0009-000 | |
| RNA FISH | RNAscope HiPlex检测 | ACD | 324100, 324140 |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD可固定Aqua活/死细胞染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| eBioscience可固定活力染料eFluor780 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Brilliant Violet 421抗小鼠CD31抗体 | BioLegend | 102424 | |
| Brilliant Violet 605抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 103140 | |
| Brilliant Violet 711抗小鼠CD11b抗体 | BioLegend | 101241 | |
| Alexa Fluor 488抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 100210 | |
| PE/Cyanine7抗小鼠F4/80抗体 | BioLegend | 123113 | |
| APC抗小鼠CD11c抗体 | BioLegend | 117310 | |
| Alexa Fluor 700抗小鼠/大鼠CD29抗体 | BioLegend | 102218 | |
| Alexa Fluor 700抗小鼠CD90.2抗体 | BioLegend | 105320 | |
| APC-Cyanine 7抗小鼠/大鼠CD29抗体 | BioLegend | 102226 | |
| TruStain FcX（抗小鼠CD16/32） | BioLegend | 101320 | |
| Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| BD FACSAria Fusion分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | Tree Star | -- | |
| scRNA-seq | Drop-Seq技术 | -- | -- |
| Maxima逆转录酶 | -- | -- | |
| Kapa HiFi PCR试剂盒 | Kapa Biosystems | -- | |
| Nextera XT试剂盒 | Illumina | -- | |
| Illumina NovaSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| 数据分析 | R语言 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| FBR模型诱导 | PCL颗粒剂量（30 mg）、手术方式（双侧股四头肌切除）、术后时间点（1或6周） 阅读提示：Methods: Volumetric muscle loss surgery and biomaterial implantation |
| p16报告小鼠构建与验证 | 他莫昔芬给药方案（70 mg/kg/day，连续5天）、MEFs处理（1 μM OHT 48小时） 阅读提示：Methods: Generation of the p16-EF/CreERT2 mouse strain, MEF isolation and culture |
| 流式细胞术检测 | 抗体组合、活性染料、细胞分选策略（CD45-CD31-CD29+） 阅读提示：Methods: Flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting |
| 批量RNA-seq | RNA提取方法、文库准备试剂盒、测序深度（30M reads）、差异表达阈值（FDR<0.05） 阅读提示：Methods: Bulk RNA library preparation and sequencing |
| 单细胞RNA-seq | 细胞分选、Drop-seq平台、数据处理流程（UMI计数、Harmony整合） 阅读提示：Methods: Drop-Seq single-cell RNA sequencing, scRNAseq computational processing |
| 迁移学习SenSig计算 | 基于批量RNA-seq的差异基因列表（FDR<0.05）、z-score归一化方法 阅读提示：Methods: Transfer learning for identification of SnCs from single-cell data sets |
| 体外共培养验证 | 衰老诱导方式（10 Gy照射，低血清处理）、共培养比例（巨噬细胞500,000/well，成纤维细胞100,000/well）、共培养时间（6小时） 阅读提示：Methods: In vitro induction of senescence, Fibroblast–macrophage co-culture |