建立AAA模型
构建小鼠腹主动脉瘤模型，模拟人AAA病理过程。
使用12周龄ApoE-/-小鼠，给予高脂饮食，通过植入含Ang II或生理盐水的渗透压泵诱导AAA，持续28天。
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基于生物信息学鉴定腹主动脉瘤免疫微环境中核心铜死亡相关生物标志物
Identification of core cuprotosis-correlated biomarkers in abdominal aortic aneurysm immune microenvironment based on bioinformatics.
实验完整度
中包含RNA测序、qRT-PCR验证、免疫荧光和Western blot蛋白验证，但缺少机制验证和体内功能实验。
主要模型
ApoE-/-小鼠Ang II诱导AAA模型 小鼠主动脉血管平滑肌细胞系MOVAS-1
重点核对
AAA模型诱导：12周龄ApoE-/-小鼠，高脂饮食，皮下植入含Ang II（1000 ng/kg速率）的渗透压泵，持续28天 细胞处理：MOVAS-1细胞，Ang II浓度为1 μmol/L，处理24小时 RNA测序样本：每组3个样本，每个样本由同组3个随机小鼠腹主动脉组织混合 差异表达筛选标准：|Fold Change| ≥ 2且q < 0.05 验证实验：qRT-PCR验证5个mRNA，免疫荧光和Western blot验证FDX1和NLRP3
摘要
背景：腹主动脉瘤（AAA）的发生与免疫微环境紊乱有关。据报道，铜死亡可影响免疫微环境。本研究的目的是鉴定参与AAA发病和进展的铜死亡相关基因。方法：通过高通量RNA测序鉴定小鼠AAA后的差异表达lncRNA（DElncRNA）和mRNA（DEmRNA）。通过Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）进行通路富集分析。通过免疫荧光和western blot分析验证铜死亡相关基因。结果：AAA后共观察到27616个lncRNA和2189个mRNA差异表达（|Fold Change|≥2且q<0.05），包括10424个上调lncRNA、17192个下调lncRNA、1904个上调mRNA和285个下调mRNA。GO和KEGG通路分析显示DElncRNA和DEmRNA涉及许多不同的生物过程和通路。此外，与正常样本相比，AAA样本中铜死亡相关基因（NLRP3、FDX1）上调。结论：铜死亡相关基因（NLRP3、FDX1）参与AAA免疫环境，可能为确定AAA治疗的潜在靶点提供新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 铜死亡相关基因在腹主动脉瘤（AAA）发病和进展中的作用及其与免疫微环境的关系。
- 核心机制
- 铜死亡相关基因NLRP3和FDX1在AAA组织中表达上调，并共定位于外膜，可能通过NOD样受体等信号通路参与AAA的免疫炎症过程。
- 主要证据
- RNA测序鉴定差异表达基因，qRT-PCR验证；免疫荧光和Western blot显示FDX1和NLRP3在AAA组织和Ang II刺激的VSMCs中表达升高，且共定位。
- 研究意义
- 首次揭示NLRP3和FDX1作为铜死亡关键蛋白在AAA发展中的生物学意义，为AAA治疗提供新靶点和新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RNA测序分析差异表达lncRNA和mRNA
鉴定AAA和对照组间差异表达的lncRNA和mRNA，并预测其功能。
提取腹主动脉RNA进行高通量RNA测序，使用Cutadapt、FastQC、Bowtie2、Hisat2、StringTie和edgeR等工具处理和分析数据，筛选差异表达基因（|log2FC|>1且q<0.05），并进行GO和KEGG富集分析。
qRT-PCR验证RNA测序结果
验证RNA测序差异表达mRNA的可靠性。
随机选择5个DEmRNA进行qRT-PCR，使用TRIzol提取RNA，反转录后进行定量检测，每个样本进行三次独立实验。
免疫荧光和Western blot验证铜死亡相关基因表达
验证铜死亡相关基因FDX1和NLRP3在AAA组织及VSMCs中的表达。
对腹主动脉组织进行免疫荧光染色检测FDX1和NLRP3的表达和定位；Western blot检测蛋白表达水平；并用Ang II处理VSMCs后检测蛋白变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MOVAS-1细胞 | 广州吉赛生物 | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 血管紧张素II | Sigma | A9525 |
| 动物实验 | 渗透压泵 | Alzet | Model 2004 |
| 免疫荧光 | 抗FDX1抗体 | Bioss | bs-11426R |
| 抗NLRP3抗体 | Abcam | ab188865 | |
| 图像分析 | Image J软件 | Rawak Software, Inc. Germany | -- |
| RNA提取 | miRvana miRNA提取试剂盒 | Ambion | -- |
| TRIzol试剂 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11836153001 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | B2064 | |
| 抗FDX1抗体 | Proteintech | 12592-1-AP | |
| 抗NLRP3抗体 | Proteintech | 27458-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | -- | -- | |
| 二抗 | CST | 7074 | |
| ECL化学发光试剂 | Sigma | GERPN2106 | |
| Biorad凝胶成像系统 | Biorad | -- | |
| qRT-PCR | 引物 | 上海生工 | -- |
| 转录组分析 | Cutadapt | -- | -- |
| FastQC | -- | -- | |
| Bowtie2 | -- | -- | |
| Hisat2 | -- | -- | |
| StringTie | -- | -- | |
| edgeR | -- | -- | |
| BLAST2GO | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AAA模型构建 | 小鼠品系（ApoE-/-）、年龄（12周）、饮食（高脂）、Ang II剂量（1000 ng/kg速率）、给药方式（皮下植入渗透压泵）、持续时间（28天） 阅读提示：见Materials and methods: Ang II induced AAA model construction |
| 细胞处理 | 细胞系（MOVAS-1），培养条件（DMEM含10%FBS），Ang II浓度（1 μmol/L），处理时间（24小时） 阅读提示：见Materials and methods: Cell culture and treatment |
| RNA测序 | 样本数（每组3个，每个混合3个组织），差异表达标准（|FC|≥2且q<0.05），测序平台（未明确），分析流程（Cutadapt、FastQC、Bowtie2、Hisat2、StringTie、edgeR） 阅读提示：见Materials and methods: RNA extraction and high-throughput RNA sequencing and Bioinformatics analysis |
| qRT-PCR验证 | 选用的mRNA（5个），引物序列（见表1），内参基因（β-actin），独立重复次数（3） 阅读提示：见Materials and methods: Quantitative real-time PCR and Table 1 |
| 免疫荧光验证 | 抗体（FDX1: bs-11426R, Bioss; NLRP3: ab188865, Abcam），孵育条件（4°C过夜），图像分析（Image J） 阅读提示：见Materials and methods: Abdominal aorta tissue collection and histological analysis and Figure 7 legend |
| Western blot验证 | 裂解液（RIPA含蛋白酶抑制剂），抗体（FDX1: 12592-1-AP, Proteintech; NLRP3: 27458-1-AP, Proteintech; GAPDH），二抗（7074, CST），检测试剂（ECL），重复次数（3） 阅读提示：见Materials and methods: Western blot and Figure 7 legend |